「三甲病理现场」课程学习笔记（二十）：肺癌少见突变分子检测

「白求恩·肿瘤病理学社」项目之「三甲病理现场」，旨在促进国内相关疾病病理诊断的规范化、增强相关分子检测意识，提高诊断水平。

第十三场直播会议中四川省肿瘤医院郭鹏教授的分享主题是《非小细胞肺癌少见突变检测》，今天为大家带来的是配套学习笔记。    

肺癌分子检测的现状

临床实践指南解读精准治疗时代下的肺癌分子分型

图1

基于肺癌新靶点的发现和药物研发，以及NMPA IVD的支持获批，中国已进入精准医疗时代；从2010年到2019年，中国肺癌分子检测数量每年增加31.8%。

图2

图3

NSCLC已进入Biomarker指导的精准治疗时代

• 基于biomarker精准治疗，目前FDA已批准多个靶向药物用于晚期肺腺癌患者；

• NCCN指南推荐对于晚期NSCLC优先biomarker检测指导临床用药选择。

肺癌少见突变分子检测方法及进展

     实践指南解读肺癌分子检测方法

每种检测方法都有优势和局限性，临床选择需综合考虑各项因素，主要包括：

• 敏感性

• 特异性

• 标本类型/数量/质量

• 检测成本（时间、用量等）

• 覆盖基因变异的种类/数量

• 其他……

图4

 基因异常检测：方式及平台

• 基因突变：Sanger, RT-PCR, dPCR, NGS：EGFR, KRAS, CMETE14, BRAF, PI3KCA, ALK……

• 基因易位：FISH, RT-PCR, IHC, NGS：ALK, ROS1, RET, NTRK,NRG1/2, FGR2……

• 基因扩增：FISH, IHC, NGS：CMET, HER2, EGFR……

• 基因表达：IHC, RT-PCR, NGS：ALK, ROS1, CMET, RET,NTRK1/2/3, FGFR1/2/3, HER2, EGFR, PDL1……

图5

 检测标本：组织标本为首选，血液标本仅为补充 液体标本 无法替代组织标本，其局限性体现在：

• 敏感性低，假阴性率30%；

• 无法诊断肿瘤组织学转化（小细胞肺癌转化）；

• 血浆检测所覆盖的基因突变范围还未及全面NGS分析的复杂度；

• 检测所有临床相关的基因重排仍存争议。

国内外指南：组织标本仍为首选，血液标本因敏感性不足，不能进行独立检测，仅作为组织标本不可及时的补充；ctDNA阴性，需要组织标本再次验证。

 ALK

ALK突变频率在3%~7%之间，中国人群约5%。不同种族间的ALK+ NCSLC发生率相对一致。

图6 最早1994年在sciencereport上Thoms.Look发表了ALK融合相关研究

2007年首次在非小细胞肺癌中发现EML4-ALK融合类型，并证实为肺癌的驱动基因；目前已发现有约27种ALK融合变异形式。

图7

非小细胞癌中ALK基因融合类型有EML4-ALK、KIF5B-ALK、KLC1-ALK、TFG-ALK和ALK-PTPN3等，其中EML4-ALK融合基因最为常见。

指南共识均推荐：ALK作为一线核心驱动基因检测

图8

NMPA批准四种方法用于ALK融合的检测

图9 研究表明，ALK检测方法之间具有较高的一致性（大多数>95%）

NSCLC中ALK检测专家共识

《中国非小细胞肺癌ALK检测临床实践专家共识（2019版）》较2013年版诊断共识和2015年版肺癌诊疗指南：进一步扩大和明确了NSCLC的ALK检测人群；将检测方法从原来的3种扩大到4种；新增了ALK检测的标本类型、变异类型、室内外质控、耐药机制检测等内容；检测策略方面也做了更新。

ALK检测主要技术平台方法比较

图10 FFPE：福尔马林固定石蜡包埋；FISH：荧光原位杂交；IHC：免疫组化；NGS：二代测序；RT：逆转录

EML4-ALK融合是最常见的ALK融合类型

• 目前已发现超过19种融合伴侣基因，其中EML4-ALK融合约占80%；

• EML4-ALK融合中最常见的变体亚型为V1和v3a/b。

根据EML4基因不同的断裂位点，目前至少发现了20多种EML4-ALK融合亚型， 其中最常见的是：

V1: 外显子13与ALK的外显子20融合[E13; A20]——长融合；

V3a / b:EML4的外显子6a / b与ALK的外显子20融合[E6a / b; A20]——短融合；[E6a / b; A20]——短融合。

EML4-ALK不同变异体的结构域的区别

•EML4的主要结构域包括BASIC结构域，HELP结构域和WD结构域。它们对ALK同源二聚体的形成和活化是非常重要的；

• 缺乏BASIC结构域，即使ALK存在也无法成瘤。HELP区域对激活下游信号非常重要，V3缺乏HELP区域，可能成瘤性减弱，对ALK TKI治疗敏感性降低EML4的WD40疏水区影响ALK融合蛋白的稳定性；

• V2疏水区较长，半衰期最短。它和ALK-TKI结合后降解地最快，从而对ALK抑制剂最敏感。

EML4-ALK V3变体生存获益更短

 图11

EML4-ALKV3驱动的NSCLC

• 更快的转移和扩散

• 更早的TKI耐药

•TKI耐药主要通过ALK的二次突变，较少通过旁路激活

• 更早的化疗进展

• 更早的颅内放疗进展

• 更短的总生存OS

 BRAF

致癌性BRAF信号激活MAPK信号通路

1. BRAF是RAF激酶家族成员之一，位于MAPK信号通路（ RAS-RAF-MEK-ERK ）中；

2. 异常激活能促进细胞的生长、增殖及凋亡。

3. 突变是否具有激酶活性

4. 激酶活性是否依赖于RAS活化

5. BRAF基因二聚化

6. BRAF基因改变分类

BRAFV600常用检测方法

• NCCN指南推荐——BRAF分子检测部分：

• 目前推荐的检测方法包括：NGS（最常用）、 RT-PCR、Sanger；

• IHC方法仍需进一步临床验证。

BRAF检测方法比较

 图12

检测BRAF突变时需注意肿瘤的异质性，同一患者的原发灶与转移灶之间的分子遗传学改变有一定差异。原发灶与转移灶不一致的原因：

• 肿瘤进展中的异质性；

• 样本选择异质性的存在。

建议1个原发灶+多个转移灶同时进行BRAF的分子检测。

 MET

肺癌MET失调的检测方法

每一种检测方法都有其优点和局限性，检测和诊断方法的选择需要考虑临床标本和可行性。

 图13

METex14跳突检测面临的挑战

• IHC检测存在较高假阴性率（漏诊）。

• MET ex14跳跃突变不是单一的“热点突变”，是一组围绕MET 14外显子剪切位点区域的不同突变、插入缺失等各种变异（可能发生在内含子区域），最终导致DNA转录成mRNA时MET ex14被剪切。

METex14 跳突检测：DNA vs RNA-based NGS

 图14

MET扩增包括原发扩增和继发扩增

FISH方法检测MET扩增

MET拷贝数增加的两种形式

• 多倍体：整个7号染色体发生扩增：单条染色体上拷贝数未增多，MET GCN ≥5，MET/CEP7<2

• 定点扩增：7号染色体上的MET基因发生扩增：单条染色体上多个拷贝数，MET/CEP7≥2

相比FISH，NGS对MET扩增的检测敏感性较差，容易漏诊 组织NGS检测的特点：

• 能检出大部分定点扩增；

• 但不易检出多倍体；

• 约45%的FISH阳性未被组织NGS检测出。

MET扩增检测未来待解决的问题

• MET多倍体的扩增是否真的为肿瘤驱动变异？

• 如何确定判定MET扩增的阈值？

 ROS1/RET/NTRK

肺腺癌中ROS1基因融合特征：

• 2003年首次在GBM细胞株中发现FIG-ROS1的融合，并证明是GBM发生的驱动突变；

• ROS1一般与其他驱动基因不共存，绝大部分与EGFR和ALK突变互斥；

• ROS1融合可在DNA，RNA和蛋白水平均能被检测。

IHC/FISH/RT-PCR/NGS方法检测ROS1融合都具有局限性

IHC 检测ROS1融合有较高的假阴性率

 图15 Abbreviations:FN,false-negative; FP, false-positive; TN, true-negative; TP, true-positive.

NCCN指南指出（FISH/RT-PCR/NGS) 检测ROS1方法都具有局限性

 图16

RET和NTRK基因

• 2012年，RET重排在非小细胞肺癌患者中首次被发现；

• RET融合发生频率：NSCLC中约0.6%-0.9%，肺腺癌中略高大约1.2%-2%；

• RET融合主要的检测方法有FISH,  IHC, RT-PCR和NGS。

• NTRK是神经营养因子受体络氨酸激酶。它们分别由 NTRK1、NTRK2 和 NTRK3基因编码。一旦与其他的基因发生融合突变，导致了异常激活驱动了肿瘤的发生；

• NTRK融合检测方法：IHC, RNA or DNA NGS, FISH, RT-PCR。

肺癌分子检测的展望和趋势

1. ctDNA的动态变化与BRAF突变NSCLC靶向治疗的疗效相关

2. ctDNA清除率越高，靶向治疗的早期疗效越好

3. 液态活检NGS与组织RT-PCR对于METex14检测一致性探索

    回顾性分析发现，液态活检NGS指导卡马替尼（Capmatinib ）治疗METex14疗效结果相似；

   液态活检NGS能够检测出绝大多数METex14阳性的病例，但会漏检部分组织学检测阳性的病例。

4. 液态活检十大研发新方向

 图17

总结

• 精准检测助力肺癌个体化精准治疗，从而改善患者预后；

• 肺癌少见突变已步入Biomarker指导的精准治疗时代，针对新靶点新药研发层出不穷；

• 不同检测方法，如IHC、FISH、PCR、Sanger、NGS等具有不同的优势和局限性，临床选择应综合考虑；

• 肺癌作为精准治疗的先行者，液态活检因其无创性和早期预测价值不断被探索。

审核：郭鹏

设计：鹏飞

排版：小明

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