科研 | 徐医大：郑葵阳、于英华和黄旭枫教授就膳食纤维缺乏经由肠-脑轴引起认知功能障碍发表新研究（国人佳作）

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在15周的FD饮食后，小鼠表现出显著的认知缺陷，包括物体位置记忆、时序记忆和日常生活活动能力受损(图1A-F)。与对照组相比，FD小鼠在物体位置测试中的位置识别指标和时序记忆测试中的时序识别指数均显著降低(p＜0.05,图1A-D)。FD组和对照组在物体位置和时序记忆上的差异不是由于日常活动的可变性，因为两组在测试阶段对物体的总探索时间具有可比性(图S1A和B)。在筑巢行为测试中，FD组表现出筑巢能力下降，因为与对照组相比，这些小鼠的未破坏巢重量更高，执事巢评分更低(p＜0.05；图1E,F和S1C)。海马突触超微结构的可塑性是认知所必需的。透射电镜显示，FD小鼠海马CA1区突触超微结构发生改变。FD小鼠突触间隙增宽，突触后密度变薄(p＜0.05，图1G-I)。此外，FD组的突触前和突触后标记物，突触素(SYN)和突触后密度蛋白95(PSD95)均降低(p＜0.05，图1J,K)。此外，15周后，FD组的能量摄入量、体重和脂肪组织重量均高于对照组(图S1D-F)。

图1 15周的膳食纤维缺乏可促进认知障碍和突触超微结构的改变。采用物体位置、时序记忆和筑巢测试评估小鼠的认知能力(A-F)(n=15)。A,B物体位置测试。A花在新位置物体上的时间占总物体探索时间的百分比。B SMART视频跟踪系统在测试阶段记录的Con和FD组的代表性轨迹图。蓝点和黄色十字符号表示在测试阶段保留在旧位置和移动到新位置的物体。C,D时序记忆测试。C识别率。D SMART视频跟踪系统在测试阶段记录的Con和FD组的代表性轨迹图。蓝点和黄色十字符号分别表示在测试阶段的熟悉的旧物体和最近熟悉的物体。E,F巢筑试验用于评估小鼠日常生活活动。E未破坏巢重量。F Con和FD组的代表性巢。G不同饮食喂养小鼠的海马CA1区突触的电镜超微结构(比例尺:500 nm)。第二行放大后的图像为第一行在虚线框标示的区域(比例尺:200 nm)。H,I突触间隙宽度和PSD厚度的图像分析(n=3)。PSD:突触后密度; SC:突触间隙; SV:突触囊泡。J,K海马区SYN和PSD95蛋白水平(n=6)。值为平均值±SEM；*p＜0.05纤维缺乏组(FD) vs.对照组(Con)。

为了鉴定与纤维缺乏引起的认知障碍有关的海马突触蛋白，我们使用基于质谱的蛋白质组学分析比较了FD小鼠和对照组小鼠的海马蛋白质组。FD组有68个蛋白下调，92个蛋白上调(图2A)。GO分析用于确定与这些蛋白相关的前10个生物过程(图2B)，这些信号通路包括G蛋白偶联受体信号通路、细胞发育、顺行跨突触信号通路、细胞胺代谢过程调控和跨突触信号通路。利用KEGG通路进一步分析改变的蛋白，并将其划分为下调的突触发生通路，包括胆碱能突触、多巴胺能突触、细胞粘附分子、γ-氨基丁酸(GABAergic)能突触、神经活性配体-受体相互作用、和细胞外基质(ECM)-受体相互作用通路(所有p<0.05,图2C)。关于上调的通路，KEGG通路分析显示了ECM受体相互作用、糖尿病晚期糖基化终产物及其受体(AGE-RAGE)信号通路、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)信号通路、磷酸肌醇3-激酶(PI3K)-Akt信号通路、非洲锥虫病和Epstein Barr病毒感染(所有p<0.05,图2C)。

FD小鼠与对照组小鼠海马区突触发生通路内的31种蛋白表达存在差异(图2D)。FD饮食诱导的突触蛋白改变被定位到蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络中(图2E)。PPI网络表明钙/钙调素依赖性蛋白激酶II delta（CaMKIId或CaMK2d）是胆碱能突触和多巴胺能突触通路之间的核心节点。CaMKIId直接与两条突触通路中的腺苷酸环化酶5(ADCY5)、溶质载体家族6成员3(SLC6A3)、G蛋白亚基4(GNG4)和胆碱乙酰转移酶(CHAT)以及其他突触蛋白相互作用，例如A激酶锚定蛋白5(AKAP5)（一种突触后支架蛋白）和肌动蛋白(ACTN)2（介导脊柱形态和突触后密度的组装）。CaMKIId还与一些参与突触可塑性和认知功能的蛋白间接相互作用，如生长相关蛋白(GAP)43(轴突和突触前终端的关键成分)和突触囊泡糖蛋白2V(SV2C)(定位于突触囊泡的膜糖蛋白)，这两种突触蛋白在痴呆患者中也会减少。接下来，在蛋白质组学分析中检测到的显著变异在海马区中使用免疫印迹进行验证。我们发现，与对照组相比，FD组海马区CaMKIId、GAP43和SV2C蛋白水平降低(p<0.05；图2F-H)。总体上，蛋白质组学结果表明，CaMKIId及其相关突触蛋白的失调导致了纤维缺乏引起的突触和认知损伤。

图2 15周的膳食纤维缺乏改变了海马突触蛋白质组。A-E海马全蛋白质组定量分析(n=3)。A差异表达蛋白的火山图。B分析GO富集生物过程中差异表达蛋白。C差异表达突触蛋白的KEGG通路分析。D差异表达突触蛋白的热图。E基于STRING数据库和Cytoscape 3.6.0进行明显失调蛋白的PPI网络分析。黑线表示两种蛋白质之间的相互作用。红色节点表示上调，蓝色节点表示下调。F-H通过western blot对下调的海马全蛋白组(CaMKIId、GAP43和SV2C)进行定量分析(n=5-6)。数值为平均值±SEM；*p＜0.05纤维缺乏组(FD) vs.对照组(Con)。 

为了阐明小胶质细胞如何调节突触连接，我们对FD小鼠小胶质细胞的形态进行了表征，并研究了小胶质细胞-突触吞噬作用。通过用Iba1抗体（一种小胶质细胞特异性钙结合蛋白）进行免疫荧光染色，我们发现FD小鼠海马CA1、CA3区和DG中的小胶质细胞数量增加、小胶质细胞体增大、小胶质分支数量减少（图3A,B)，以及Iba1蛋白水平增加（p<0.05，图3C）。对Iba1⁺细胞的Sholl分析显示，FD组中激活的小胶质细胞增加，表现为循环指数增加和分支指数降低（p<0.05；图3D,E）。此外，我们发现FD小鼠海马区促炎细胞因子、肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6和IL-1β的水平增加（p<0.05，图3F），表明促炎M1激活。FD组小胶质细胞中CD68(吞噬标记物)的免疫荧光强度上调(图3G)，海马区mRNA和蛋白水平升高 (p<0.05，图3H,I)。FD组小胶质细胞包裹的PSD阳性斑点增加(图3J)，表明膳食纤维缺乏可激活小胶质细胞，并诱导吞噬海马区突触。在观察到纤维缺乏引起的神经炎症之后，我们发现FD小鼠的蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)增加（p<0.05，图3K），这是一种将炎症与突触改变交联的重要介质。PTP1B可以抑制CaMKII的激活，并损害pCaMKIIpGSK3β突触发生通路，导致Tau磷酸化，它是几种神经退行性疾病的关键标志。与这些发现一致，我们观察到膳食纤维缺乏会降低pCaMKII和pGSK3β的水平（p<0.05，图3L,M）并上调pTau（p<0.05，图3N）。综上所述，这些结果表明，纤维缺乏诱导小胶质细胞激活介导的突触吞噬，并改变海马突触信号分子。

图3 15周的膳食纤维缺乏可导致小胶质细胞吞噬海马区突触和神经炎症-突触丢失。A Iba1免疫荧光染色(比例尺:50 μm)，图像从标有虚线的框中捕捉(比例尺:10 μm)。B量化海马CA1、CA3区和DG中的Iba1⁺细胞数量(每只小鼠2张图像，n=6)。C海马区Iba1蛋白水平(n=6)。D,E Iba1⁺细胞的循环指数和分支指数(每只小鼠2张图像，n=3)。F海马区促炎细胞因子TNFα、IL-6和IL-1β mRNA表达(n=5)。G海马区CD68的免疫荧光染色代表性图像，比例尺:25 μm。H海马区CD68 mRNA表达(n=6)。I海马区CD68蛋白水平(n=6)。J高分辨率共焦图像的正交视图显示了Iba1(绿色)和PSD95(红色)的共定位(比尺:5 μm)。K PTP1B蛋白水平(n=6)。L-N海马区pCaMKII/CaMKII、pGSK3β/GSK3β和pTau/Tau蛋白水平(n=6)。*p＜0.05纤维缺乏组(FD)vs.对照组(Con)。

肠道内稳态对大脑功能很重要。我们检测了纤维缺乏是否扰乱了肠道内环境稳态，包括肠道屏障完整性、通透性、炎症和肠道微生物群。使用阿尔新蓝染色，我们发现，与对照组相比，FD组结肠粘液层的厚度减少（p<0.05，图4A,B），这通过内粘液层MUC2染色得到证实(图4C)。FD组小鼠结肠组织中抗菌肽Reg3γ mRNA表达降低(p<0.05，图4D)。FD组微生物群与上皮组织的距离较短(图4E)，表明细菌聚集和粘液浸润。此外，FD小鼠显示出较低水平的上皮紧密连接蛋白、occludin和zonula occludens-1 (ZO-1)（p<0.05，图4F）和较高水平的粪便白蛋白、血清LPS（p<0.05，图4G,H)，表明上皮屏障完整性受损和肠道通透性增加。此外，FD组的肠道炎症和全身炎症增加，因为FD小鼠结肠（p<0.05，图S1G）和血清（p<0.05，图S1H）中的TNFα、IL-6和IL-1β mRNA表达增加。FD饮食后结肠长度缩短(图4I)。

接下来，利用16S rRNA基因测序分析纤维缺乏对肠道微生物多样性和组成的影响。主成分分析(PCoA)显示出相对分离的分布格局，说明FD组与对照组的微生物群落β-多样性存在明显差异(图4J)。在α多样性方面，纤维缺乏显著降低了Chao1、Ace和Sob指数(p<0.05，图S2A-C)，但不包括Shannon物种多样性指数(图S2D)。在门水平上，对照组和FD小鼠肠道微生物群主要由厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和变形菌门(Proteobacteria)组成(图4K)。与对照组相比，FD小鼠中拟杆菌门显著减少，而变形菌门显著增加(p＜0.05，图4L)。利用LEfSe分析发现，拟杆菌门中的细菌类群也有所减少，如拟杆菌纲（Bacteroidia）、拟杆菌目(Bacteroidales)、S24-7科和Prevotella属(图4M和图S2E)。而FD小鼠则增加了变形菌门中类群的富集，包括δ变形菌纲(Deltaproteobacteria)、脱硫弧菌目(Desulfovibrionales)和黄色单胞菌目(Xanthomonadales)、脱硫弧菌科(Desulfovibrionaceae)和黄色单胞菌科(Xanthomonadaceae)、嗜胆菌属(Bilophila)和寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)(图4M和图S2E)。此外，我们发现拟杆菌门和变形杆菌门中改变的微生物与物体位置、时序和筑巢行为测试的认知指标显著相关(图4M)。这些结果强烈表明，拟杆菌门和变形杆菌门肠道菌群的宿主特异性改变是纤维缺乏小鼠认知功能下降的标志。此外，使用KEGG注释和功能富集，我们确定了18个功能类别，它们在FD组和对照组之间表现出不同的富集水平（图S2F）。FD组中与氧化磷酸化相关的功能降低(图4N)。KEGG通路分析还表明，膳食纤维缺乏引起的肠道菌群失调与微生物代谢能力下降有关(图S2F)，包括叶酸生物合成、叶酸碳库、鞘糖脂和过氧化物酶体的生物合成，它们参与神经系统的发育和功能。

图4 15周的膳食纤维缺乏会破坏肠道屏障，引起肠道炎症和微生物群改变。A对结肠粘液层定量进行统计分析(每只动物2个切片，n=5)。B阿尔新蓝染色结肠切片来显示粘液层(箭头)。相反的带有竖线的黑色箭头描绘了被测出的粘液层。比例尺:50 μm。C结肠切片MUC2(绿色)和DAPI(蓝色)染色的免疫荧光图像。相反的带有竖线的白色箭头描绘的是粘液层。比例尺:50 μm。D RT-PCR定量结肠中Reg3γ (n=6)。E使用通用细菌探针EUB338-Alexa Fluor 488(绿色)和细胞核染色试剂DAPI(蓝色)对结肠切片进行FISH分析。箭头表示细菌与上皮组织间的距离；比例尺:10 μm。F结肠中occludin和ZO-1蛋白表达水平(n=5)。G粪便中的白蛋白浓度(n=8)。H血清内毒素水平(n=10)。I对结肠长度定量进行统计分析(n=9)和具有代表性的结肠图像。J盲肠微生物组Bray距离的主坐标分析图。K,L丰富菌门组成。M肠道微生物群和认知行为之间的联系。利用线性判别分析(LDA＞2.0)鉴定出了25个微生物类群。中间热图中的颜色强度(蓝色到红色)表示每个微生物群的标准化丰度得分。散点图中每个点的大小和颜色分别显示了不同微生物群与认知行为之间的Spearman相关p值(范围为6.62e-8~0.80)和相关系数(范围为-0.94~0.98)。N利用PICRUSt从16S rRNA基因序列预测3级KEGG功能通路差异。值为平均值±SEM；*p＜0.05纤维缺乏组(FD)vs.对照组(Con)。缩写:p,门。

为了研究纤维缺乏引起的肠道改变是否早于认知改变，我们分析了肠道微生物群和其他结肠参数，以及短期(7天)纤维缺乏(FDST)小鼠的认知行为。我们发现肠道微生物谱(图5A)和物种丰富度(Chao1、Ace和Sob指数)存在显著差异(p＜0.05，图5B-D)，但物种多样性(Shannon指数)无显著差异(图5E)。此外，短期FD饮食显著减少了拟杆菌门(Bacteroidetes)，并增加了变形菌门(Proteobacteria) (图5F,G)，11个功能性直向同源物发生改变(图S3A)。有趣的是，我们发现短期纤维缺乏可损害肠道黏膜屏障，阿尔新蓝染色和MUC2抗体染色的结肠粘液层厚度下降(图5H-J)，但结肠紧密连接和炎症标志物没有改变(图S3B-H)。最后，短期FD饮食没有改变认知行为(图5K-N)和体重(图S3J)，但显著增加了能量摄入(图S3I)。因此，在认知功能改变之前，短期纤维缺乏会改变肠道内环境稳态，包括微生物群和结肠粘液屏障。

图5 在纤维缺乏饮食7天后，观察到肠道微生物群改变和粘液层变薄，但认知能力没有下降。A Bray距离主坐标分析图。B-E盲肠微生物群α-多样性由Chao1指数(B)、Ace指数(C)、Sob指数(D)和Shannon指数(E)描述。F,G丰富菌门组成。H阿尔新蓝染色结肠切片来显示粘液层(箭头)。相反的带有竖线的黑色箭头描绘了被测出的粘液层。比例尺:50 μm。I对结肠粘液层定量进行统计分析(每只动物2个切片，n=5)。J结肠切片MUC2(绿色)和DAPI(蓝色)染色的免疫荧光图像。相反的带有竖线的白色箭头描绘的是粘液层；比例尺:50 μm。采用物体位置(K,L)和筑巢(M,N)测试小鼠(n=15)的认知能力。K花在新位置物体上的时间占总物体探索时间的百分比。L物体探索的总时间。M筑巢评分。N未破坏巢重量(筑巢材料的数量)。值为平均值±SEM；**p＜0.05短期纤维缺乏组(FD-ST) vs.对照组(Con)。缩写:p,门。

短链脂肪酸(SCFAs)是肠道菌群发酵膳食纤维的重要代谢产物。在本研究中，我们发现FD小鼠血清中乙酸、丙酸和丁酸的浓度均比对照小鼠降低60-70%(p＜0.05；图6A-C)。为了确定SCFAs在FD饮食增加肠道通透性中的作用，我们使用SCFAs受体敲除小鼠（GPR41^-/-和GPR43^-/-小鼠）。这些小鼠在结肠组织中表现出紧密连接蛋白、ZO-1和occludin水平下降(p＜0.05,图6D)。此外，在GPR41^-/-和GPR43^-/-小鼠的物体位置、时序记忆和筑巢行为测试中，表现出认知指数降低(图6E-G，图S4A-C)，海马突触蛋白pCaMKII和SYN水平降低(图6H,I)。因此，纤维缺乏导致的SCFAs减少和SCFAs受体失活可能是肠功能障碍与认知障碍之间的中介因素。

为了确定SCFAs水平的下降是否可归因于纤维缺乏后肠-脑轴的改变，我们用SCFAs处理FD小鼠(FDS)15周。与未添加SCFAs的FD组相比，补充SCFAs显著提高了小鼠的物体位置记忆、时序记忆和筑巢能力(p＜0.05，图6J-L和图S5A-C)。SCFAs恢复了FD饮食诱导的海马突触蛋白SYN和PSD95的减少(图6M,N)。此外，补充SCFAs抑制了小胶质细胞的激活(图S5D-H)、小胶质细胞对突触的吞噬作用(图S5I-K)和神经炎症(图6O)。另外，与FD小鼠相比，SCFAs部分恢复了结肠粘液厚度的减少(图6P,Q；图S6A和B)并改善了结肠抗菌性能(图6R)、上皮紧密连接(图6S)、通透性(图S6C和D)以及结肠和全身炎症(图S6E-G)。这些发现表明，补充SCFAs可以预防由纤维缺乏饮食引起的肠-脑轴功能障碍。

图6 纤维缺乏减少短链脂肪酸对认知障碍至关重要。A-C持续15周的纤维缺乏饮食(FD)小鼠血清乙酸、丙酸和丁酸水平降低(n=6)。D-I检测GPR41^-/-和GPR43^-/-小鼠中肠-脑轴参数。D结肠中occludin和ZO-1蛋白表达水平(n=5)。进行了物体位置(E)、时序记忆(F)和筑巢(G)测试(n=8-10)。E花在新位置物体上的时间占总物体探索时间的百分比。F识别率。G未破坏巢重量(筑巢材料的数量)。H,I海马区pCaMKII/CaMKII和SYN蛋白水平(n=6)。J-S补充短链脂肪酸(FDS)对FD小鼠肠-脑轴的影响。进行了物体位置(J)、时序记忆(K)和筑巢(L)测试(n=15)。J花在新位置物体上的时间占总物体探索时间的百分比。K识别率。L未破坏巢重量。M,N海马区SYN和PSD95蛋白表达水平(n=6)。O海马区促炎细胞因子TNFα、IL-1β和IL-6 mRNA表达水平(n=5)。P阿尔新蓝染色结肠切片来显示粘液层(箭头)。相反的带有竖线的黑色箭头描绘了被测出的粘液层。比例尺:50 μm。Q对结肠粘液层定量进行统计学分析(每只动物2个切片, n=5)。R RT-PCR定量结肠Reg3γ(n=6)。S结肠中occludin和ZO-1蛋白表达水平(n=5)。*p＜0.05 vs野生型(WT)或对照组(Con)；#p＜0.05 vs.纤维缺乏组(FD)。