Science：首次在人类原代T细胞中进行CRISPR激活和抑制筛选，为下一代细胞治疗提供新靶点

撰文 | 王聪

编辑 | 王多鱼

排版 | 水成文

CRISPR-Cas9 基因编辑技术，通过向导RNA （gRNA） 将Cas9酶靶向目标DNA序列，Cas9酶切割目标DNA双链，造成DNA双链断裂，DNA在非同源末端连接 （NHEJ） 修复时出错，从而实现基因敲除。

斯坦福大学 亓磊 等人率先开发出了dCas9，这是一种突变Cas9酶，它保留了Cas9结合DNA的能力，但却不切割DNA双链，将dCas9与转录激活蛋白结合，就能实现对特定基因的激活，即CRISPRa；而将dCas9与转录抑制蛋白结合，就能实现对特定基因的抑制，即CRISPRi。CRISPRa和CRISPRi扩展了CRISPR基因编辑技术的应用范围，为功能基因筛选提供了新的工具。

人类T细胞对抗原刺激的反应，包括细胞因子的产生，对于健康的免疫功能至关重要，而这种反应可能在自身免疫疾病、免疫缺陷疾病和癌症中失调。通过功能增益 （激活基因表达） 或功能缺失 （抑制基因表达） 来了解调控T细胞活性的基因，对于免疫相关疾病的治疗，以及改进CAR-T等细胞疗法具有重要意义。

CRISPRa和CRISPRi 是在永生化的细胞系中进行功能增益（激活基因表达）或功能缺失（抑制基因表达）研究的强大工具，但在原代细胞中进行这种大规模基因筛选研究仍然具有挑战性。

近日，加州大学旧金山分校的 Alexander Marson 等人在 Science 期刊发表了题为：CRISPR activation and interference screens decode stimulation responses in primary human T cells 的研究论文。

该研究开发了 在人类原代T细胞中进行CRISPRa和CRISPRi的基因功能筛选平台 ，并将其应用于T细胞响应刺激的细胞因子产生的功能调节基因的全基因组筛选。

近年来， Alexander Marson  一直致力于使用CRISPR-Cas9技术来敲除各种人类免疫细胞上的基因，希望从中发现能够帮助免疫细胞更好地对抗感染、炎症或癌症的基因，从而更好地开发细胞免疫疗法。但这种基于CRISPR-Cas9的基因敲除，无法确定某些基因增强后会如何，因此，研究团队开始使用CRISPRa来进行相关研究。

研究团队优化了基于慢病毒的递送方法，以使CRISPRa组分能够高效且可扩展地递送到原代人类T细胞中。然后使用这个平台进行全基因组CRISPR筛选，以发现T细胞中的细胞因子产生的调控基因。根据CD4+T细胞中内源性白介素-2 （IL-2） 或CD8+T细胞中干扰素-γ （IFN-γ） 产生的水平，通过荧光进行分选。同理进行CRISPRi筛选。

CRISPRi筛选发现了MALT1、BCL10等基因促进T细胞表达细胞因子，而CRISPRa筛选发现肿瘤坏死因子超家族受体4-1BB、CD27、CD40、OX40等促进T细胞表达细胞因子，二者在发现T细胞的细胞因子产生功能性调控基因方面相互补充。

进一步的，研究团队还开发了结合CRISPRa和单细胞RNA测序的平台CRISPRa Perturb-seq，对70个由全基因组筛选发现的功能调节基因进行深度分子表征，以揭示细胞因子产生的调节基因如何调节T细胞活化并将细胞编程为不同的刺激响应状态。

总的来说，该研究开发了一个强大的研究平台，可在原代人类T细胞中进行大规模CRISPRa和CRISPRi筛选，并成功对能够调节细胞因子产生的基因网络进行全基因组筛选。并结合单细胞RNA测序对这些筛选到的基因进行进一步功能表征。这些研究为改下一代细胞疗法提供了新的靶点。

论文链接 ：

https://www.science.org/doi/10.1126/science.abj4008