从多领域视角探索肠道区域诱导乌珠穆沁羊胃肠道微生物群落的变化

编译：微科盟阿Z，编辑：微科盟茗溪、江舜尧。

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导读  

胃肠道（GI）微生物群是最复杂的微生物生态系统之一，在调节与营养吸收和稳态维持相关的生物过程中至关重要。尽管在描述肠道区域的细菌群落方面已经取得了一些成果，但跨胃肠道非细菌群落的变化在很大程度上仍未被探索。为了解决这个问题，我们通过针对细菌、真菌和古细菌的扩增子测序，研究了乌珠穆沁羊（Ovis aries）整个胃肠道的微生物生物地理学。结果表明，胃肠道三个区域（胃、小肠和大肠）的群落结构均有显著差异，并且基于跨域网络分析，在小肠中检测到更强烈和有效的物种相互作用。此外，这里还揭示了胃肠道区域之间微生物组装机制的域间差异，其中细菌群落主要由变量选择控制（解释了约62%的分类群转换），而真菌和古细菌群落主要由均质分散控制（分别解释了约49%和60%的转换）。总体而言，这些数据强调了胃肠道微生物结构和装配机制的胃肠道部分和结构域依赖性，表明在评估胃肠道选择对肠道微生物群落的影响时，应明确考虑多结构域。

论文ID

原名：Gut region induces gastrointestinal microbiota community shift in Ujimqin sheep (Ovis aries): from a multi-domain perspective

译名：肠道区域诱导乌珠穆沁羊（Ovis aries）胃肠道微生物群落的变化：从多领域视角

期刊：Environmental Microbiology

IF：5.491

发表时间：2021.9.20

通讯作者：余志晟

通讯作者单位：中国科学院大学资源与环境学院

DOI号：10.1111/1462-2920.15782

实验设计

实验结果

1 绵羊胃肠道微生物群的微生物多样性和总转换率

通过我们目前的测序工作，我们从所有胃肠道中检测到4376、1213和569个操作分类单元（OTUs），它们分别对应于细菌、真菌和古细菌库。厚壁菌门（Firmicutes）OTUs占优势，占绵羊不同胃肠道细菌群落的12.16%至27.99%。在真菌和古细菌群落中，座囊菌纲（Dothideomycetes）和热原体纲（Thermoplasmata）OTUs在真菌和古细菌群落中占主导地位，分别占每个群落（未分类或norank分类群除外）总OTUs的平均31.46%和31.08%。胃中原核生物群落的丰富度（Chao 1指数）显著高于小肠和大肠（Duncan检验，P < 0.05），而大肠中真菌物种丰富度最高（表1）。除真菌群落的Shannon指数外，胃肠道中其他α多样性指数的趋势与Chao 1指数的结果基本一致（表S1-S3）。

表1. 不同胃肠道间α多样性指数的比较。

 Obs. OTUs，观察到的操作分类单元（OTUs）的数量；Chao 1，Chao 1丰富度估计量；Shannon，Shannon多样性指数；PD，系统发育多样性；Good’s coverage，Good’s coverage估计；本表中的每个指数的数值表示为平均值±S.D。同一列中的不同字母代表不同肠道区域的显著差异（Duncan检验，P < 0.05）。

基于胃肠道微生物群的整体群落组成的β多样性分析显示了不同胃肠道之间的明显变化（表2；图S1）。基于Bray-Curtis距离的差异性检验表明，根据置换多变量方差分析（PERMANOVA，P < 0.001）和多反应置换程序（MRPP，P < 0.001）的结果，任何比较的胃肠道之间的肠道微生物群均存在显著差异。基于Bray-Curtis距离的非度量多维尺度分析（NMDS）也证实了这些不同的胃肠道群落模式（图1A-C），揭示了同一胃肠道断面的肠道微生物群通常被分组在一起。

表2. 基于置换多变量方差分析（PERMANOVA）和多反应置换程序（MRPP）的不同胃肠道间差异检验。

2 绵羊胃肠道中微生物组成的变化

在门或类水平上，肠道微生物群的组成在绵羊胃肠道中呈现出清晰的模式（图1D-F）。检测到的细菌的相对丰度表明大肠中的厚壁菌门显著丰富（Duncan检验，P < 0.05；图S2A）。相反，其他细菌如拟杆菌门（Bacteroidetes）在胃中最为丰富，而放线菌门（Actinobacteria）和变形菌门（Proteobacteria）在小肠中最为丰富。在真菌群落中，大肠主要由座囊菌纲（Dothideomycetes）和锤舌菌纲（Leotiomycetes）定殖，而胃和小肠分别优先被新美鞭菌纲（Neocallimastigomycetes）和粪壳菌纲（Sordariomycetes）定植（图S2B）。大多数古细菌群落由产甲烷菌群组成，包括甲烷杆菌纲（Methanobacteria）和甲烷微菌纲（Methanomicrobia）（均占古细菌总序列的82.60%），其次是热原体纲（Thermoplasmata）（在所有胃肠道样本中平均为16.56%）。这些古菌在不同胃肠道中的分布模式也发生了显著变化。例如，甲烷杆菌纲在小肠中明显占优势（>90%），而甲烷微菌纲和热原体纲分别在大肠（>70%）和胃（>30%）中明显占优势（图S2C）。

图1. 细菌（A）、真菌（B）和古细菌（C）的非度量多维缩放分析，并根据整个绵羊胃肠道的分类信息进行。带绿色圆圈的符号表示胃样本，蓝色方块表示小肠，红色三角形表示大肠（A-C）。在门水平上可视化细菌群落的分类信息，在纲水平上可视化古细菌和真菌群落的分类信息。平均丰度小于1%的门或纲归类为“其他”。

为了在更精细的水平上阐明微生物的变异，沿绵羊胃肠道的分类分配被映射到属水平上。每个胃肠道中大多数（>90%）肠道菌群所共有的类群丰度相对较高（>0.1%），并被确定为核心肠道微生物群。这些核心属占微生物丰度的80%以上，在整个绵羊胃肠道中也表现出明显的变化。如图2所示，绵羊胃肠道中类似的优势微生物一般聚集在特定的胃肠道区域，因此产生类似的颜色模式，但跨越三个主要胃肠道区域的模式可能会发生显著变化。例如，在胃中发现的解琥珀酸菌属（Succiniclasticum）、纤维杆菌属（Fibrobacter）和Anaeromyces的共变分类群数量相对较多，但在小肠和大肠中相对缺乏。此外，基于效应大小线性判别分析（LefSe）表明，在三个胃肠道中也观察到32个代表属，这揭示了最有可能解释来自三个主要胃肠道区域样本之间观察到差异的微生物（图S3）。胃中的核心细菌属包括普氏菌属（Prevotella）、密螺旋体属（Treponema）以及古细菌属甲烷微菌属明显占优势（P < 0.05）。成员包括细菌属瘤胃球菌属（Ruminococcus）和聚乙酸菌属（Acetitomaculum）、真菌属隐球酵母属（Cryptococcus）、古细菌属甲烷球形菌属和甲烷短杆菌属（Methanobrevibacter）（包括瘤胃甲烷短杆菌属Methanobrevibacter ruminantium、Methanobrevibacter millerae和Methanobrevibacter sp. AbM4）在小肠中显著富集（P < 0.05）。大肠中的微生物属包括拟杆菌属（Bacteroides）、荚孢腔菌科（Sporormiaceae）真菌属和古细菌属甲烷粒菌属（Methanocorpusculum）（P < 0.05）。

图2. 热图显示了不同胃肠道中细菌（A）、真菌（B）和古细菌（C）群落的核心属。这里的丰度是log2转换的。

  3 三个主要胃肠道区域网络拓扑特征的变化

构建分子生态网络以了解不同胃肠道的物种相互作用。数据集分为三类：胃、小肠和大肠，每个网络分别有632、338和591个节点（图3）。在所有情况下，网络连通性分布曲线均符合幂律模型（R2 > 0.86；表3），这表明所构建的网络呈现无标度和小世界的特征。通常来说，胃网络中的大部分链接与拟杆菌门（40.71%）相关，而小肠（63.27%）和大肠（67.64%）网络中的大部分链接与厚壁菌门相关。结果还显示了跨胃肠道的共生网络的不同拓扑特性。尤其是小肠网络，与胃和大肠网络相比，小肠网络具有更高的平均度和聚集系数，以及更短的平均路径距离（表3），这表明这里的物种相互作用比其他胃肠道群落更强、更有效。此外，我们发现胃网络中阳性共现的比例低于小肠和大肠，这表明胃群落的竞争活动程度高于其他胃肠道群落。值得注意的是，上述三个网络仅共享28个节点，其中大多数节点是唯一的，即仅在一个胃肠道区域检测到（图S4），这表明大多数微生物在不同的胃肠道中具有其特殊的生态位。

此外，基于Zi-Pi图（图S5），识别网络中节点的不同角色。大多数微生物被归类为外围微生物（97.31%），表明与它们相关的连线很少或者大部分连线位于它们的模块内。同时，有28个、13个和1个节点分别被分类为模块中心、连线和网络中心。由于这些节点在其自身模块（模块中心）内或模块（连线）之间或两者（网络中心）之间具有重要的连接作用，因此被视为关键微生物。胃网络（12个模块中心、12个连线和1个网络中心）中的关键微生物比其他网络中的关键微生物多。在这25个关键物种中，大多数属于厚壁菌门和拟杆菌门，这些关键物种的精细分类结果可在表S4中找到。有趣的是，一些节点在一个网络中作为关键物种，但在另一个网络中作为外围微生物出现，这表明相同的OTUs根据特定的胃肠道环境表现出不同的作用。

图3. 胃（A）、小肠（B）和大肠（C）中肠道微生物群的共存模式。节点表示操作分类单元（OTU）水平的分类从属关系。每个节点的大小与度数成正比，节点的颜色代表不同的分类信息（门级）。节点之间的连线表示这些OTUs之间存在显著相关性（P < 0.05），网络中带有红线和蓝线的连线分别表示正相关和负相关。

表3. 胃肠道微生物网络的拓扑特征及其相关随机网络。随机网络是通过100次运行重新布线生成的。

4 控制绵羊胃肠道微生物群装配的生态过程

为了确定哪些过程控制着绵羊胃肠道微生物的装配，我们计算了三个主要胃肠道区域中的β-最近分类单元指数（βNTI）和基于Bray-Curtis的Raup-Crick（RCBray）（图4）。如图4A所示，大多数胃肠道间细菌的系统发育转换与零预期显著不同（1.82%的案例中βNTI < -2，61.76%的案例中βNTI > 2）。在其余的胃肠道对中，近一半（53%）的分类转换率低于随机预期（RCBray < -0.95）。这些结果表明，在大多数胃肠道对中，变量选择主导了细菌的组装，而均质扩散在导致分类转换等方面发挥了重要作用（图4G）。相反，真菌群落中胃肠道对中的大多数（90.74%）与零期望值无显著差异（｜βNTI｜ < 2，图4B）。在这些样本对案例中，54.35%表现出较小的分类转换，37.79%表现出与零预期无显著差异，这表明均质分散和漂移往往是真菌装配过程中的主要驱动因素（图4H）。而对于古细菌群落，我们还发现大量胃肠道对（89.07%）之间的系统发育转换与零预期没有显著差异（图4C），其中近67.12%的分类转换小于零预期（图4F）。这些结果表明，在大多数胃肠道样本中，随机过程在引起古细菌群落的系统发育转换中起着最重要的作用，而均匀分散被认为是观察到的分类转换的主要驱动因素（图4I）。

此外，控制胃肠道对内群落转换的过程通常受均匀化扩散的调节。具体而言，大肠样品（包括3个微生物区）均质扩散率平均超过75%，其次是胃中的65%和小肠样本中的46%。漂移在胃肠道微生物群的装配中也起着重要作用，尤其是在小肠样本对中占主导地位（平均30.30%）。值得注意的是，控制胃肠道微生物群的结构过程的比例在三个微生物域之间也有所不同（图S6），这进一步证实了在不同微生物域之间形成微生物装配的独立分析要求。

图4. 标准化系统发育转换（βNTI；A-C组分别代表细菌、真菌和古细菌）和分类学转换（RCBray；D-F组分别代表细菌、真菌和古细菌），以及肠道区域中控制细菌（G）、真菌（H）和古菌（I）群落组成的生态过程的贡献总结。虚线标记了βNTI图中-2和2的位置，以及RCBray图中-0.95和0.95的位置。

讨论

哺乳动物胃肠道微生物生态系统对宿主健康和行为表现的重要性已得到充分证实；然而，大多数研究只关注细菌，迄今为止对宿主胃肠道真菌和古细菌群落的了解相对有限。我们研究的目的是探索乌珠穆沁羊胃肠道所有三个微生物区的微生物多样性、组成和相互作用模式，并进一步阐明胃肠道群落聚集的机制。在这项研究中，我们展示了绵羊胃肠道在三个微生物区的差异多样性模式（表1）。与其他反刍动物一致，我们的研究结果表明，与小肠和大肠相比，绵羊胃中的细菌群落更加多样，这可能与外部环境持续摄入外来微生物有关。相比之下，在大肠中发现了真菌群落中最多样化的群落。越来越多的研究揭示了真菌和细菌群落之间的紧密相关性，这些关系会影响群落装配，我们的结果表明，微生物群落之间相对较弱的竞争可能解释了大肠中较高的真菌多样性。基于共现网络，我们发现胃中细菌和真菌OTUs之间的负相关（87.5%）比小肠（50%）和大肠（10.11%）更多。物种之间的负相互作用可能是由有限资源或空间的竞争引起的，因此相互排斥。因此，胃内真菌和细菌之间的强大竞争关系抑制某些真菌生长似乎是合理的，而大肠内的真菌多样性则随着这种竞争关系的减弱而增加。与细菌和真菌群落不同，古细菌群落的多样性非常有限，只有六种古细菌被识别为显性物种，而大多数古细菌物种被定义为新的和未描述的物种（表S5）。值得注意的是，近40%的未分类古细菌仅在胃中检测到，这表明未来需要更多的培养工作或功能宏基因组学筛查来探索绵羊胃中的不同古细菌群落。

我们观察到，无论比较哪种微生物域，不同绵羊胃肠道的微生物群落结构存在差异（表2）。尽管个体差异也可能影响胃肠道微生物的装配，但我们的结果表明，胃肠道区域比个体差异对绵羊胃肠道微生物群的组成具有更强的决定因素。胃肠道微生物结构的差异可由多种因素驱动，包括pH值、氧气水平、营养供应和流速；因此，同一胃肠道内的类似条件可以选择性地装配大多数群落共有的核心微生物（图2）。这里检测到的几种核心微生物的特征和功能在以前的文献中已有报道。例如，在我们的研究中，胃中富集的普氏菌属已被广泛证实与高碳水化合物和高纤维饮食呈正相关，因为它有可能将复杂的多糖分解为较小的多糖和单糖的潜力。拟杆菌属是大肠中具有代表性的核心属，据报道广泛分布于倾向于消耗低纤维高蛋白饮食的个体中。值得注意的是，在我们的研究中，普氏菌属和拟杆菌属在不同的胃肠道中富集，这与之前的研究一致，即普氏菌属水平高的受试者通常具有较低的拟杆菌属水平。这些结果表明，这两个属可能是对抗性的，例如，在局部肠道环境中竞争同一生态位。此外，基于网络分析，我们还发现了绵羊胃肠道中这些核心属之间的一些显著相关性。例如，在小肠中富集的瘤胃球菌属和甲烷短杆菌属彼此之间存在显著的正相关关系。Stams和Pluge已经证明，瘤胃球菌属可以向产甲烷菌提供H2，而产甲烷菌可以刺激瘤胃球菌属从相同数量的底物中生成更多ATP，因此这两个属之间呈现了共生关系。相比之下，有益细菌包括普氏菌属（生产丙酸）和Saccharofermentans（生产琥珀酸）显示出与密螺旋体属广泛的负相互作用，其中许多菌株被报道为几种哺乳动物中的隐形病原体。这些有益微生物和病原体之间的相互作用可能意味着它们在维持宿主体内平衡和健康方面的潜力。总的来说，绵羊胃肠道可以选择性地过滤特定的微生物成员，使其成为胃肠道定植者，参与形成复杂的种间相互作用来为宿主服务。

根据共生网络的拓扑特性，发现小肠微生物组比其他胃肠道中的微生物组具有更强的生物相互作用。据报道，食糜在绵羊小肠中的平均停留时间仅为1.5-4.5小时，这为微生物在小肠中定殖和增殖创造了相对不利的条件。有限的停留时间可以促进某些能够适应不利条件以及具有共同生态位的微生物的定殖，而在短时间内无法形成紧密联系的微生物则会进入大肠。同时，较短的平均路径距离和较高的平均程度表明，微生物类群之间的代谢物和信息交换途径更加有序。更密切的生物关系可以确保小肠的代谢效率，从而促进局部营养物质的消化和吸收。此外，我们还发现，与小肠和大肠相比，胃网络中负/竞争性共存的比例更高。多样性群落中的激烈竞争可能有利于化感物种，而不断增加的化感关系可能改善常驻微生物群落抵御外来病原体入侵的屏障。胃网络中广泛分布的负相互作用可能突出了胃作为接触广泛食物材料的第一个消化部位，有效抵抗外来病原体和保护宿主健康的重要性。

此外，还根据已建立的生态框架研究了绵羊胃肠道微生物群落的装配机制。事实上，越来越多的研究已经揭示了胃肠道细菌群落的装配机制，而很少有研究系统地监测胃肠道生态系统中真菌或古细菌群落的潜在机制。在这项研究中，我们基于跨胃肠道的比较，揭示了三个微生物域中的不同装配机制。胃肠道中的大多数细菌群落受确定性过程控制，其中变量选择是构建细菌群落的最重要过程。如许多先前的研究所示，宿主物种、发育阶段、饮食和胃肠道等多种因素都会对胃肠道细菌装配产生很大影响。一种可能的解释是，鉴于我们研究中的绵羊个体处于相同的发育阶段（成体）和饮食模式（自由放牧），肠道栖息地过滤或宿主特异性选择驱动了胃肠道细菌群落的装配。相反，随机过程在胃肠道真菌和古细菌群落的装配中起着主导作用。换句话说，与细菌相比，可变或选择性环境因素对胃肠道真菌和古细菌装配的影响较小，这可能归因于它们与细菌相比的生理/形态差异，因此更好地适应肠道环境。例如，真菌的菌丝网络（有利于水和养分的吸收）和古细菌的长期进化史（对极端条件的耐受范围广泛）可以促进它们对整个胃肠道不同环境的抵抗力。此外，均质化扩散促成了整个肠道区域的大部分古菌和真菌装配过程，这表明胃肠道间的扩散似乎主要由迁移决定。如Venn图所示，高丰度的真菌和古细菌OTUs在这些胃肠道之间共存（分别占真菌和古细菌总序列的94.98%和98.66%，图S7），交叉验证了这些微生物迁移的可能性。值得注意的是，栖息在同一群落中的不同微生物域装配的对比机制已在一系列系统中得到揭示，在包括海水、生物土壤结皮、冰川和湖岛。我们的研究首先证实，栖息在胃肠道生态系统中的微生物的不同领域也可以通过不同的过程来构建。还需要进一步研究来确定不同的微生物群如何在胃肠道生态系统中施加选择/扩散功能。

结论

总之，我们的研究从多领域的角度描述了乌珠穆沁羊胃肠道的肠道微生物群。我们的研究结果表明，无论是细菌、真菌还是古细菌群落，绵羊胃肠道内的微生物结构均存在显著差异，表明其肠道内存在强烈的成分分化和生境过滤。不同的绵羊个体可以在同一胃肠道内选择性地塑造核心微生物，并作为定殖者参与营养代谢和宿主健康。基于多域微生物的共生网络分析强调了三个主要胃肠道区域之间的不同拓扑特征，其中在小肠中检测到最强的微生物相互作用。此外，我们出人意料地揭示了胃肠道样本中三个微生物结构域之间的对比装配机制。我们发现，在同一元群落中，细菌主要是通过变量选择构成，而真菌和古细菌主要是通过均匀分散构成。这些发现扩展了我们对胃肠道如何影响微生物群落结构和相互作用的认识，并阐明了在三个微生物领域形成胃肠道微生物组合的生态机制。还需要进一步的实验测试来确定影响胃肠道微生物群落变化的决定因素。

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