免疫相关lncRNA分型竟然发表在14分Nature子刊！

导语

lncRNA与肿瘤发生、进展、预后密切相关。因此，有必要将lncRNA 纳入临床前模型以开发预后生物标志物。

背景介绍 

今天小编为大家带来一篇神奇的文章，作者似乎仅仅利用TCGA和GEO公共数据集构建了免疫相关的lncRNA模型，做了pcr和免疫组化验证就发表了nature communications，而且是最近发表的（2022年2月10日）。让我们一起来学习一下14分+的思路吧！

数据介绍

全部数据来自公共数据库，包括 TCGA和GEO的17个数据集的2277例结直肠癌（CRC）患者 。另外包括6个氟尿嘧啶辅助化疗的 药物相关数据集和 3个氟尿嘧啶辅助化疗联合贝伐单抗的药物相关数据集。 

结果解析 

01   免疫相关的lncRNA   本文研究设计分为六个步骤。第一，通过WGCNA和GSEA综合确定免疫相关的lncRNA。第二，确定用于分型的signature和模型。第三，调查其他的临床和分子特征。第四，在临床队列中验证。第五，lncRNA模型的临床意义。第六，lncRNA模型与药物或免疫治疗效果。

具体来说，首先，根据单样本基因集富集分析（ssGSEA）评估的28个免疫细胞浸润进行聚类分析，将所有结直肠癌样本分为k (k=2-9) 个cluster。 当 k=2时最佳（图1A、B ）。 两个cluster（C1和C2）在免疫浸润方面表现出显著差异 ，C2的总体浸润丰度明显高于C1（图1C，D）。 因此，将C1定义为“免疫冷”肿瘤，将C2定义为“免疫热”肿瘤。 为了确保分析算法不会对两个共识集群产生偏差，使用了TIMER、quantTIseq、MCP-counter、xCell、EPIC和ESTIMATE六种算法来验证ssGSEA结果的稳定性和鲁棒性。

图1

然后，鉴定免疫浸润相关的lncRNA模块。在加权共表达网络分析（WGCNA）中，识别出12个模块。在黄色模块和免疫cluster之间观察到模块-性状关系的最高相关性（图1F）。识别了526个基因显著性（GS）>0.5和 MM>0.6的hub lncRNA（图1G）。

最后将791个免疫调节中起关键作用的富集基因lncRNA与WGCNA结果取交集，得到235个重叠的lncRNA用于后续分析（图1I）。

02   构建免疫相关lncRNA风险模型  

基于上述的235个免疫相关lncRNA，作者使用单变量Cox分析确定了43个影响预后的lncRNA，构建免疫相关lncRNA特征模型(IRLS)。在TCGA-CRC数据集中，通过LOOCV框架拟合了101种预测模型，并计算了每个模型在所有验证数据集中的C-index（C指数）（图2A）。最佳模型是Lasso和stepwise Cox模型的组合（图2A），最终确定了16个lncRNA（图 2C）。

使用这16个lncRNA计算风险评分（图2C）。根据survminer包确定的最佳临界值，将所有患者分为高危组和低危组。高风险组患者的总生存期（OS）明显低于低风险组。多变量Cox回归表明，在调整了可用的临床特征后，模型仍然具有统计学意义，这表明免疫相关lncRNA是患者生存的独立危险因素。

图2

03   在队列中评估模型  

作者使用ROC分析和C指数测量了模型的预测能力（图3A）。此外，还计算了两个与时间无关的指标——综合 AUC和综合Brier评分。所有这些指标表明，免疫相关lncRNA在多个独立队列中具有稳健表现。作者又比较了该模型与其他临床和分子变量在预测预后方面的表现。发现免疫相关lncRNA和AJCC阶段的组合可以进一步提高模型的预测能力。

图3

04   机器学习生成预后Signature并与IRLS比较  

使用10种机器学习算法（随机生存森林、弹性网络、Lasso、Ridge、逐步 Cox、CoxBoost、plsRcox、监督主成分、广义增强回归模型和survival-SVM)生成结直肠癌预后signature。分为四步：（1）单变量Cox回归确定CRC队列的预后lncRNA；(2) 对预后lncRNA执行101种算法组合，以拟合CRC队列中基于留一法交叉验证 (LOOCV) 框架的预测模型；(3) 在六个验证数据集中检测到所有模型；(4) 对于每个模型，在所有验证数据集中计算Harrell的一致性指数 (C-index)，平均C-index最高的模型为最优模型。

最终得到了109 个signature（包括mRNA和lncRNA标签）。作者将免疫相关lncRNA（IRLS）的C-index与其他signature进行了比较，发现IRLS在每个数据集中都显示出比其他所有模型更好的性能（图4B）。

图4

05   在临床队列中进行验证  

为了进一步验证IRLS模型在临床中的性能，通过qRT-PCR评估了这些 lncRNA在232 名CRC患者队列中的表达。Kaplan-Meier表明，IRLS高的患者的OS和RFS显著降低（图5A、B）。

在控制了混杂变量（包括年龄、性别、T分期、N分期、M分期、AJCC分期、微卫星状态、化疗和ICI治疗）后，IRLS模型对于OS而不是RFS仍然具有统计学意义（图5C、D)。ROC分析显示OS的预测效果良好（图5E）。总之，临床验证集结果支持了先前的发现，即IRLS模型可以作为CRC的独立预测因子。

图5

06   免疫相关lncRNA与药物  

lncRNA与基于氟尿嘧啶的辅助化疗和贝伐单抗的敏感性和耐药性有关。作者评估了IRLS在量化基于氟尿嘧啶的辅助化疗和贝伐单抗益处方面的预测价值，发现对治疗响应者的IRLS分数显着高于非响应者（图6A-E）。ROC表明，IRLS可以准确预测基于氟尿嘧啶的辅助化疗的治疗效果（图6G-L）。总之，IRLS高的患者往往对氟尿嘧啶类辅助化疗敏感，对贝伐单抗耐药，而IRLS低的患者对贝伐单抗敏感，对氟尿嘧啶类化疗耐药。

图6

07   免疫相关lncRNA与免疫检查点抑制剂  

作者发现IRLS模型评分和免疫浸润丰度之间存在显著负相关（图7A、B）。为了验证CD8A在不同IRLS水平下的蛋白质表达，进行了免疫组化实验（包括 56个模型高风险和48个模型低风险结直肠癌样本。结果显示，CD8A的表达在低风险组中显著升高（图7E、F）。这表明IRLS低的患者可能拥有更多的ICI治疗后备资源。

值得注意的是，IRLS可以准确预测dMMR/MSI-H 表型（图7K-M），这表明IRLS是微卫星状态估计的有利替代物。此外，作者调查了IRLS和共有分子亚型 (CMS1-4) 之间的关联。CMS1亚型的IRLS评分低于其他亚型。因而绘制了ROC曲线以进一步评估IRLS在识别CMS1亚型结直肠癌患者中的准确性，IRLS的AUC相对较高，分别为0.915（TCGA-CRC）和0.859（Meta-GEO）。

图7

小编总结

看到这里大家可能也发现本文的亮点了。第一，使用了10种机器学习算法进行组合，并与免疫相关lncRNA确定的signature进行比较，发现本文构建的模型性能更加优秀。第二，工作全面，故事完整，着重添加了模型预测化疗、单抗、免疫治疗效果的分析。第三，补充了pcr和免疫组化，虽然简单，但是干湿结合更加有力。如果大家将流程理解清楚，应用于其他癌症，相信又是一篇高分文章！       

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