科研 | Nature子刊（IF：17.745）：粪菌移植后细菌菌株的精确定量描述了长期移植情况并解释了结果

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编译：微科盟如风，编辑：微科盟茗溪、江舜尧。

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导读  

粪便菌群移植（FMT）已成功应用于治疗人类复发性艰难梭菌Clostridium difficile感染（CDI），但缺乏一种精确的方法来测量是哪些细菌菌株能稳定地移植到受者体内，并评估其与临床结果的相关性。我们从22名FMT供体和受者的粪便样本中收集了> 1000种不同的细菌菌株进行培养。利用我们收集的菌株和来自相同样本的宏基因组测序数据，我们开发了一种名为“Strainer”的统计方法，用于从宏基因组测序数据中检测和跟踪细菌菌株。我们应用Strainer评估了13个FMT纵向临床干预队列，并检测到在FMT后5年内71%的供体微生物菌群稳定植入受体。我们发现，FMT前80%的受体肠道细菌菌株被FMT消除，FMT后存在的菌株与环境获得的菌株一起持续存在长达5年。供体细菌菌株在受体中的定量移植可以独立地解释初次和重复FMT后的临床结果（复发或成功）（精确度100%，召回率95%）。我们报告了一份细菌种类和菌株的概要，随着时间的推移，这些细菌和菌株可以用于定义的活体生物治疗产品，并作为FMT的替代。综上，我们通过将定量的菌株植入受体的分析框架和使用Strainer方法可以用于系统性地评估FMT或定义活菌治疗研究。

论文ID

原名：Precise quantification of bacterial strains after fecal microbiota transplantation delineates long-term engraftment and explains outcomes

译名：粪便菌群移植后细菌菌株的精确定量描述了长期移植情况并解释了结果

期刊：Nature Microbiology

IF：17.745

发表时间：2021年9月27日

通讯作者：Jeremiah Faith

通讯作者单位：美国西奈山伊坎医学院

DOI号：10.1038/s41564-021-00966-0

实验设计

前言

粪便菌群移植（FMT）已被广泛用于治疗复发性艰难梭菌Clostridium difficile感染（CDI），因为它比万古霉素更有优势。一些研究表明，接受FMT后受者的肠道菌群与健康供者的相似，表明肠道菌群得到了恢复。然而，这些研究未能抓住共生科赫定理的最基本原则，即只有在FMT后，并非FMT前，从供体中分离出离散的细菌菌株，可作为纯培养物从治愈的受体中分离出来。在第一次成功的临床试验之后的8年时间里，有数万例成功的FMT，关于FMT如何改变受体的肠道菌群，还有一些基本的但未解决的问题。目前还不清楚FMT供体粪便中的哪些菌种能够或不能够被移植。哪些菌株在FMT前定植于受体中，且在移植后仍持续存在，以及移植和持续存在的菌株是否是所产生的菌群的持久成员，这些问题尚未解决。受体菌群中来自供体、受体或环境的菌群比例也尚未明确。菌株移植和持续存在的特性是否能预测FMT后的复发也没有报道。

我们知道，肠道菌群的功能影响是在菌株的层面上。因此，我们在这个分辨率上对肠道菌群进行量化，对了解FMT的治疗潜力及其对宿主健康和疾病的影响至关重要。最近，美国食品和药物管理局（FDA）的几项建议与FMT的严重不良事件有关，增加了对使用整个粪便的未定义FMT的安全担忧。在FMT过程中，菌株级别的分辨率和对可培养的离散菌株传播的跟踪，可以为治疗性定义的混合微生物作为FMT的应用更安全、可扩展的替代品提供一个途径。 

在宏基因组学中实现菌株级的分辨率一直是个挑战，因为人类的肠道菌群由每个物种中的许多细菌菌株组成，其中大多数没有被分离出来，甚至没有用测序法检测出来。因此，以前的微生物组分析都集中在较低的分辨率上，因为找到离散细菌菌株的划分特征是FMT菌株追踪的必要步骤，是一个挑战。虽然信息丰富，但仅有宏基因组学的方法需要非常深入的测序来跟踪使用标记基因中的单核苷酸多态性（SNPs）的菌株，且不将菌群建模为一组确定的离散菌株，其主要提供与FMT样本间共享宏基因组组装细菌片段或SNPs相关的不可量化推断。如果我们要理解FMT期间菌株的传播和共生科赫定理的满足情况，那么将细菌遗传变异与一个离散的单元（即培养的细菌分离物）联系起来是至关重要的。

为了实现精确的菌株追踪，我们开发了一种高通量的混合方法，首先使用已发表的方法对FMT供体和受体的菌株进行培养和测序，然后使用本文介绍的统计方法在宏基因组样本中追踪这些菌株，我们将其命名为Strainer。

结果

1 策划、培养和测序的FMT菌株的收集

我们从7名FMT健康供体和13名复发性CDI 的FMT受体中分离了2,987株细菌，分别代表1008株独特菌株（207个种），并进行了全基因组测序（表1、图1和补充表1、8、9）。与我们之前的分析相同，全基因组相似度<96%的细菌分离物被定义为独特菌株；否则，它们被认为是代表菌株的多个分离株。我们从用于FMT的7个供体粪便样本和FMT前及FMT后长达5年的受体样本中，对85个宏基因组的样本进行了测序。正如之前的研究，这些培养的菌株代表了大部分的宏基因组，70%（标准差=16%）的细菌宏基因组读数映射到培养的菌株基因组上。我们还通过将人类粪便灌胃到无菌小鼠（n=9），对小鼠粪便样本进行宏基因组学研究，来评估我们培养的细菌菌种库的全面性。我们培养的细菌菌株组解释了相关人类粪便定植的无菌小鼠中高达 90% （标准差 = 9.2%; 扩展数据图1b） 的细菌读数，表明人类样本中大多数无法解释的细菌宏基因组学读数来自不可培养的来源（例如，来自食物和环境中的死亡细菌），或者系统地无法在小鼠肠道中生长。

表1 供体和受体的样本。

7例供体为13例复发性CDI或同时患有复发性CDI和IBD的患者提供FMT。对所有粪便样本进行粪便宏基因组学研究。供体菌株从所有供体分离，并随时间推移跟踪匹配受体的宏基因组。在FMT前后也从少数受体中分离出了菌株。M和C表明宏基因组学或培养分别在指定的时间点进行。成功表明该患者没有复发。a样品在重复FMT后采集（由于FMT初始失效）。

 图1 FMT研究设计概述，包括供体、受体和对粪便样本进行宏基因组测序和细菌菌种培养的时间点。

2 Strainer算法的开发

利用宏基因组学数据进行菌株追踪的核心挑战是确定一组来自细菌基因组的信息序列特征或称k-mers，可以独立地识别任何特定的菌株。由于每个物种包含许多密切相关的不同菌株，它们共享大部分的基因组内容（扩展数据图1c），因此，识别追踪菌株所需的信息特征是一个挑战。我们通过去除那些与细菌基因组和粪便宏基因组广泛共享无关的、非同源个体的k-mers（k = 31），来识别菌株最有价值的k-mers，在这种情况下，出现同一菌株的概率非常低（补充表1和扩展数据图1d；我们算法的概述显示在扩展数据图1e中）。接下来，我们将宏基因组学样品中的每个测序读数分配给一个独特的菌株，方法是将读数上的k-mers分布与先前为该菌株确定的信息性k-mers进行比较。接下来，我们将一个菌株的指定读数映射到其基因组上，以调整测序深度和覆盖率的均匀性。最后，我们比较了宏基因组样本中某一菌株与不相关样本菌株的不同位置读数的数量，并对该菌株的存在进行了置信度评分。

3 Strainer对无菌小鼠确定性群落的验证

我们测试了Strainer准确检测细菌菌株的能力，分别从3个不同的人类粪便样本和10个普通人类肠道常见共生细菌卵形拟杆菌Bacteroides ovatus的10个独特菌株的子集中分离细菌的准确培养物（图2a和补充表2），依次给无菌小鼠灌胃。我们用精确度和召回率来量化我们在这些简化群落中的总体表现，精确度和召回率分别为100%和86.9%，在280种不同的测试中没有出现假阳性（特异性100%）。

图2 Strainer能准确检测肠道菌群中的细菌菌株。a. Strainer能从无菌小鼠中分离卵形拟杆菌B. ovatus菌株。每列代表一个独立的无菌小鼠，用特定的卵形双歧杆菌B. ovatus菌株灌胃，有或没有不同的人类肠道细菌培养文库菌株。菌株F和G分别包含在人类文库1和2中。人类培养文库3不含卵形双歧杆菌B. ovatus，而其余的卵形双歧杆菌B. ovatus分离株是从其他人类粪便样本中分离出来的。绿色框表示该菌株被引入小鼠体内并在宏基因组学中检测到（真阳性）；灰色表示未检测到菌株（真阴性）；橙色表示检测到菌株但未引入（假阳性）；黄色表示未检测到菌株，但在小鼠中进行了灌胃（未知，因为灌胃菌株并不总是导致稳定的定植）；b. 基于SNP推断的菌种检测算法ConStrains、Strain Finder、inStrain和我们的Strainer方法在检测无菌小鼠中B. ovatus菌种数量上的表现；c. 精确-召回曲线，评估基于SNP推断的菌株追踪方法和Strainer在真实数据集上的表现，这些数据集包括在无菌小鼠中连续灌胃一组确定的菌株、FMT供体受体配对以及随时间在健康个体中跟踪菌株稳定性；d. 对于Strainer将菌株与分离出来样品的宏基因组相匹配的能力进行性能评估。实线表示将我们的算法应用于从健康对照中分离的261株菌株后不同测序深度的结果。蓝色表示250万（M）读数的测序深度，而虚线表示在从复发性CDI患者中分离出的56株菌株上应用Strainer后的结果。虚线曲线是来自IBD患者的54株菌株。精确召回曲线的AUC如图所示。

4 Strainer的基准测试

我们从匹配的和宏基因组测序的FMT样本中分离出的菌株数据集，这为严格比较宏基因组学中追踪SNP菌株代理的基于SNP的推断方法提供了一个体内实验基础。我们在无菌小鼠数据集上测试了先前发表的Strain Finder、ConStrains和inStrain算法。这些SNP代理算法是在模拟和体外数据集上开发的，比我们基于参考的方法多了一个挑战，即它们必须首先从宏基因组数据本身推断出菌株。任何没有推断出的菌株都会导致整个数据集的假阴性，任何推断错误的菌株都会在任何被错误检测的样本中传播假阳性。因此，我们首先测试了每种算法估计每只小鼠中卵形拟杆菌B. ovatus菌株的正确数量的能力。然而，所有的算法都难以做到这一点，而Strainer的检测结果与灌胃小鼠体内卵形拟杆菌B. ovatus菌株数量基本一致（图2b，Strainer的R2 = 0.99）。然后，我们测试了这些推断的菌株是否与灌服给无菌小鼠的菌株相匹配。为此，我们为每个菌株（来自其纯培养物）提供了未组装的原始测序读数（约210万），作为一个独特的宏基因组“真实”样本，并确定是否有任何算法可以将这些未组装的菌株读数与正确的宏基因组学样本相匹配。这些算法都无法做到这一点（图2c），但inStrain可以正确识别来自不同菌株基因组的未组装读数。在这项研究中，ConStrains和Strain Finder算法的灵敏度为0，而inStrain的灵敏度为10.1，我们的方法为88.7。所有的算法都没有出现假阳性。

5 Strainer对复杂人体肠道菌群的验证

为了在更现实和具有挑战性的情况下评估Strainer，我们接下来在几个复杂的人类肠道菌群群落中进行了测试，这些群落的物种重叠度很高，但几乎没有菌种重叠。这类似于FMT的应用案例，即必须在多个个体中精确检测可能传播的细菌菌株，同时将其与同一物种的其他相关共生菌株进行区分。我们对10个不相关的个体的粪便宏基因组以及从相同的粪便样本中分离出的261个细菌菌株的基因组进行了测序（补充表3），然后评估了Strainer在正确的个体宏基因组中检测这些菌株的能力，同时在其他9个样本中不会错误地检测到它。在每个样品有1000万条宏基因组读数的情况下，我们达到了93.9%的精确度，召回率为72.4%，曲线下面积（AUC）为0.86（图2d）。尽管我们在更深的宏基因组学中达到了略高的召回率，但即使是50万个宏基因组测序读数也足以达到95.8%的精度，召回率为57.6%（图2d）。我们从5名复发性CDI患者和4名肠易激综合征（IBD）患者中产生了类似的测试数据集（补充表4和5），发现复发性CDI的AUC略高，因为复发性CDI的肠道微生物组的多样性低（图2d）。虽然我们报告了较高的总体AUC，但一些分类顺序比其他分类顺序更容易检测（补充表6），对于可用参考基因组数量少的物种，以及通过高选择性培养富集分离的物种，其性能受到影响，因为培养比宏基因组学更敏感。总之，这些结果表明，我们的算法可以准确地跟踪宏基因组中已测序的细菌菌株，从而可以量化离散供体菌株在FMT中的传播。

6 复发性CDI患者的FMT菌株动力学

在一个临床队列中（图1和表1中的FMT研究设计概述），6个FMT供体各自向一个受体提供他们的样本，在FMT后的多个时间点进行采样，而有1个供体向7个不同的患者提供样本。

以前的方法已经证明，在复发性CDI中，供体和受体之间在FMT后共享菌群，但对移植的精确量化仍未解决。我们使用Strainer测量供体菌株在受体中的移植情况，并将供体菌株的移植比例（PEDS）指标定义为FMT后受体中检测到的供体菌株数量除以从供体中分离出的菌株总数。我们在FMT后对10名未复发的受体进行了长达5年的追踪，发现供体菌株的移植情况一致且稳定（图3a和扩展数据图2a中的供体-受体对子的个体轨迹）。在这些个体中，我们报告了36小时的平均移植率为83%（标准差=9%），8周时稳定在71%（标准差=16%）（通常注意到的衡量疗效的临床终点），即使5年后也一直保持在71%（标准差=9%）的高水平，表明FMT对肠道菌群的操纵可以导致一组稳定的供体细菌菌株在复发性CDI患者中近乎永久地植入。隶属双歧杆菌Bifidobacteriales目的菌株在8周时移植率较低（67%），而拟杆菌Bacteriodales目的菌株移植率较高（92%，扩展数据图2b）；我们很少观察到来自乳酸杆菌Lactobacillales目的移植。

我们发现51个属于拟杆菌Bacteroidales目的菌株中，有50个在8周内移植的菌株在6个月或更长的时间范围内保持稳定（扩展数据图2c）。然而，属于双歧杆菌Bifidobacteriales目的菌株中，在8周时移植，在6个月或更长的时间范围内保持稳定的较少（11个中只有5个，P<10-5，Fisher精确检验）。

图3 受体的FMT菌株长达5年的动态。a.来自供体的菌株（n = 6个生物独立样本）在移植后成功的FMT患者（n = 13个生物独立样本）中保持稳定的移植至少5年。每个时间点的数据以平均值±s.e.m表示；b. 在FMT之前从受体身上分离出来的菌株（n = 7个生物独立样本）迅速消失，有一小部分在较长的时间范围内持续存在。每个时间点的数据以平均值±s.e.m表示；c. 在FMT后的患者中检测到的供体、受体和环境菌株的比例。环境菌株在来源上是非供体和非受体（在FMT之前），在FMT后进行培养和宏基因组检测；d. FMT后患者中检测到的菌株数量，按主要系统发育分类群（目级）分类，并根据其来源着色。

7 通过培养验证细菌菌种的移植情况

FMT后对供体和受体的菌株进行分离和测序是对共生科赫定理的验证。通过培养证明来自多个物种和不同FMT干预措施的供体细菌菌株的传播，除了验证共生科赫定理外，还可以提供额外的移植证据。因此，我们还培养了5个受体在FMT前后的菌株（图1a），并将其与供体的菌株组成进行比较，以实验验证细菌菌株的传播。在FMT之前，我们从未在任何受体中分离出供体菌株；然而，在FMT之后，我们在受体中分离出48个供体菌株（补充表7），包括16个不同种类。如果我们用不同的算法对这些在供体和受体中分离的标准菌株的算法追踪性能进行量化，我们的FMT追踪方法的总体灵敏度为92.9（有1个假阳性），而inStrain为25.3，Strain Finder为0，ConStrains为1.4（图2c）。对于纵向培养的样本的追踪，即在一个健康人的多个时间点上，我们的算法的总体灵敏度为96.6（没有假阳性），而inStrain为21.8，Strain Finder为0，ConStrainins为3.4。通过对人体的、经实验验证的菌种传播数据集的比较，证明了Strainer优于现有的方法。

8 原有的常驻菌株被FMT取代

一些研究表明，常驻的微生物菌株创造了生态位，这反过来又会影响供体细菌在FMT后的移植。因此，确定FMT前的细菌菌株并了解它们在移植后的持续动态变化至关重要。我们在7个受体中分离并测序了FMT前的常驻菌株，并在每个受体的宏基因组中对它们进行了长达5年的追踪。与PEDS指标类似，我们将受体菌株的持续性比例（PPRS）定义为FMT后观察到的受体菌株与FMT前培养的总受体菌株之间的比率。与供体菌株的快速高移植情况不同，我们发现PPRS的下降更为渐进（图3b和扩展数据图2d中供体-受体对的个体轨迹），总体持续性在1周时下降到49%（标准差=28%），8周时下降到21%（标准差=10%）（P<0.02，Wilcoxon检验）。属于双歧杆菌Bifidobacteriales目的受体菌株总是在FMT后的8周内持续存在（7个）。然而，乳酸菌Lactobacillales目和肠杆菌Enterobacterales目的受体菌株基本上被FMT消除了。在以前的研究中，我们主要观察到受体肠道菌群的不稳定性；然而，我们的方法表明，原始菌株的一个子集仍然持久地定植状态。

9 FMT后非供体菌株的移植

我们接下来调查了供体和FMT前受体肠道菌株的生态位占用情况。我们分离并追踪了5个FMT后的菌株，发现了24个非供体和非受体的菌株，这些菌株在FMT后的受体中被宏基因组检测并培养出来。平均而言，FMT后的患者中，8.9%的菌株来自FMT前的受体，79.6%的菌株来自供体，11.5%的菌株是非供体或非受体来源的（图3c）。虽然它们的来源和转移方式不详，但这些环境菌株属于FMT前在健康供体和受体中检测到的系统分类（图3d），其定植模式相似（扩展数据图2f）。这些结果表明，大约11.5%的受体生态位空间被其他来源的菌株稳定地定植，定义的活体生物治疗产品（LBPs）的生态位占有率更有限，所以需要获取更多的环境微生物使得宿主完全定植。另外，这些生物可能代表了在移植前在供体和受体中低于检测或培养极限的菌株，尽管这似乎不太可能是所有菌株的情况，因为许多是来自我们的基准中精度和召回率非常高的分类组（图3d）（补充表6）。

10 供体移植解释了复发性CDI FMT的临床结果

FMT干预措施通常在FMT后的8周时间点时评估疗效，即比较达到临床终点的患者和未能达到终点的患者的数量。PEDS为了解FMT的临床成功或复发提供了一个潜在的定量代用标志物。在本队列中的两名在FMT后8周内早期复发的患者中，我们发现与成功达到FMT后8周无CDI复发的临床终点的患者相比，PEDS明显降低（图4a，P=0.03，双侧Wilcoxon检验）。这表明，供体菌株在受体中的精确移植可以独立解释FMT干预的早期临床结果，因为个体可以通过17%的PEDS阈值完美地分为复发或不复发。

图4 供体植入解释复发性CDI FMT的临床结果。a. 8周时的PEDS可以预测复发性CDI患者（n = 13个生物独立样本）FMT的早期复发。双侧Wilcoxon检验用于估计统计显着性；b. PEDS指标可以阐明初次FMT后复发CDI的患者重复FMT的成功结果；c. 我们的方法对独立记录所有可用FMT样本的预测能力。每当我们报告临床成功时，发现植入率高于17%的阈值（n = 19 个真阳性）和1个假阴性。临床复发总是与低植入率（n = 2 真阴性）独立相关，没有假阴性；d. 在多个受体中稳定移植的高传播性菌株中，菌株的移植和识别。前4列是来自供体每周的宏基因组样本，而第5列是5年后的供体样本。接下来的6列来自没有早期复发的FMT接受者。最后一列来自5年后的一位受体。Strainer用于从相应的宏基因组学样本中找出每种细菌菌株的存在（绿色）或不存在（黄色）情况。

经验性的临床结果表明，接受重复FMT的人往往在第二次就做出反应。接下来，我们评估了我们的PEDS指标是否能阐明这些患者重复FMT的结果。两名早期失败的受体（R095和R311）接受了重复剂量的FMT，并在未来的时间点（包括R095的5年后）报告了临床成功（即没有复发CDI复发）。重复用药后，PEDS明显升高（图4b）。

由于PEDS能够解释患者重复FMT的复发和的结果，我们评估了我们方法对所有可用的FMT样本的整体预测能力，其中临床评估是独立记录的（图4c）。每当我们报告临床成功（即没有复发）时，我们发现移植率高于17%的阈值（n = 19个真阳性），有1个假阴性。同样地，临床复发总是与低移植率独立相关（n = 2个真阴性），没有假阴性。总之，这些结果表明，在任何时间点上，供体菌株的移植率都是一个准确和稳健的指标（精确度=100%，灵敏度=95%），可以独立解释FMT的临床结果，且无论是初次FMT还是重复FMT后。然而，导致患者FMT不成功的较低移植率的原因仍不清楚。

R285号患者在原本成功的FMT中出现了非常低的移植率，而且没有复发（扩展数据图3）。该患者的报告显示，在第30天时移植率高达77%，第58天时为72%，第300天时减少到4%，5年后再次增加到72%。该患者在2个月和5年后都没有症状，这与预期一致，因为在这些时间点有较高的移植率，这就是为什么低移植率最初令人惊讶。然而，该患者在FMT后第258天因严重腹泻和使用抗生素而住院，这也许解释了他们的宏基因组在第300天测得的低PEDS，尽管这表明他们的微生物组在42天的相对较长的时间内没有恢复。重要的是，这个人没有受到重复FMT，这表明FMT后第300天的较低移植率导致大部分移植的菌株减少到我们算法的检测极限以下，但令人印象深刻的是，它们并没有从肠道中消除。

11 为确定的活体细菌治疗法选择细菌菌株

对FMT进行精确分析，以确定可用于治疗复发性CDI的可培养的独特菌株，为选择最小的混合细菌提供了途径，用于确定的LBP可作为FMT的更安全和可扩展的替代品。利用我们的分析方法和Strainer，我们确定了经人体测试的供体粪便菌群的可培养移植部分和未移植的菌株。定义的LBPs很重要，因为它们比FMT更具可扩展性，并减少了将多重耐药生物体传播给受体的机会，而常规FMT不能排除这种可能性。供体D283被用于多个（n=5个非复发）受体，因此为我们提供了更多的能力来检测单一菌株的移植一致性（图4d）。我们关注那些在D283的5个非复发受体中至少有4个能稳定移植的高传播性菌株，发现那些属于细菌目的菌株总是能移植（100%，19个中的19个，甚至长达5年），这表明这些菌株和其他在成功治疗的患者中能稳定移植更长时间的菌株，可能被用来治疗LBPs。我们提供了一份来自所有供体的物种概要，以及每个物种的菌株在受体中移植的频率（表2）。这些移植的菌株和物种提供了有效的成分，可以在未来的试验中选择使用。

表2 经常性移植的物种概要。

根据其在不同受体中的培养和移植效果，对一套用于LBP的菌种进行鉴定。“供体数量”对应的是该物种的菌株被培养或宏基因组检测的供体。“培养的菌株数”代表该物种培养和宏基因组检测的独特菌株。“转移到的受体数量”对应于接受该物种菌株的FMT受体数量（对该物种培养的每个菌株分别计算）。“移植到受者体内的菌株数量”代表在受者体内移植至少8周的菌株（一个常见的临床终点）。“移植效果”的计算方法是“菌株移植”（第5栏）和 “转移到的受体”（第4栏）的比率。在本研究中，我们只考虑有2个或更多菌株在受体中移植的细菌种类。

讨论

我们开发了Strainer算法来追踪宏基因组测序数据集中的测序细菌菌株。结合高通量菌种培养和13对供体和受体在多个时间点的宏基因组测序，我们对现有的算法进行了严格的基准测试，结果显示，大多数FMT供体菌株（>70%）和少数受体菌株（<25%）在非复发患者的FMT后至少保留5年。这些结果表明，FMT代表了对宿主菌群的半永久性改变，即一种来自单次给药的明显的持久性治疗，其稳定性与健康对照组相似。我们的结果表明，PEDS是FMT成功和CDI复发的预测措施。虽然成功的FMT与供体菌株的高移植率有关，但这种移植是由来自一个分类组的菌株促成的，这些菌株的移植率非常好，与以前的研究一致，并表明特定的菌株组决定了FMT干预的长期结果。

我们承认，我们的方法依赖于培养的细菌菌株的测序情况，这些菌株通过宏基因组进行检测和跟踪。高通量菌种培养和分离的方法正在改进，但仍然受到成本、时间和某些物种的微生物培养难度等因素的限制。我们的方法最适合于使用一个供体或一个为许多受体使用确定的LBP的疗法。如果为不同的治疗领域开发出与FMT等疗的LBPs，这将可能是最主要的情况。此外，我们研究中的体内菌株基因组和宏基因组基准，结合快速增加的细菌基因组数量来更好地定义每个物种的全基因组，可能会促进算法改进或参数的发展，用于培养独立的菌株跟踪。

我们研究框架的定量性质可用于指导肠道微生物菌群操作研究设计，超出临床疗效。例如，如果口服FMT胶囊与结肠镜下输注供体材料的移植和结果相似，那么未来的研究设计可能依赖于侵入性较小的口服给药。一些FMT试验使用了数周内的多次移植，我们的框架和算法可以准确评估移植的收益，以确定重复剂量的成本/效益。

最近，FDA发布了多个安全警报，涉及FMT的使用和因FMT所用粪便材料中的多重耐药生物体传播而导致的严重不良事件风险。我们研究的一个重要结果是确定了一种精选的活菌株混合物，这些菌株在FMT后无症状的患者中可稳定移植5年。这些菌株是合成不含多重耐药生物体的LBP的理想起点，可以作为复发性CDI的FMT替代品。