科研 | Gut Microbes：细菌短链脂肪酸的抗炎作用部分由内源性大麻素介导

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编译：微科盟小木，编辑：微科盟茗溪、江舜尧。

导读  

内源性大麻素(endocannabinoid, EC)系统在体内具有多种功能。它在能量稳态和代谢紊乱的发展中起着关键作用，是肠道微生物群与宿主代谢关系的中介。在本研究中，我们探讨了内源性大麻素系统和肠道微生物在调节炎症标志物中的功能相互作用。使用6周运动干预(处理组n=38，对照组n=40)和横断面验证队列(n=35)研究的数据，我们分析了2-花生四烯酸甘油(2-AG)、花生四烯乙醇胺(AEA)、N-油酰乙醇胺(OEA)和N-棕榈酰乙醇胺(PEA)与肠道微生物组组成、肠道衍生代谢物(SCFAs)和炎症标志物的横断面和纵向关联。在基线时，AEA和OEA与α多样性(β(SE)=0.32(0.06),P=0.002; 0.44(0.04), P<0.001)和产生SCFA的细菌，如Bifidobacterium(2-AG β(SE)=0.21(0.10), P<0.01; PEA β(SE)=0.23(0.08), P<0.01)、Coprococcus 3和Faecalibacterium(PEA β(SE)=0.29(0.11), P=0.01; 0.25(0.09), P<0.01)呈正相关，而与Collinsella呈负相关(AEA β(SE)=-0.31(0.12),P=0.004）。此外，我们发现AEA与SCFA丁酸正相关(β(SE)=0.34(0.15)，P=0.01)。运动干预组的AEA、OEA和PEA均显著升高，对照组则保持不变。AEA的改变与SCFA丁酸相关，而AEA和PEA的增加与TNF-ɑ和IL-6的减少相关，这在统计学上介导了SCFAs对这些细胞因子的三分之一的作用。我们的数据显示，SCFAs的抗炎作用部分是由EC系统介导的，这表明可能还有其他途径通过肠道微生物群参与调节免疫系统。

论文ID

原名：The anti-inflammatory effect of bacterial short chain fatty acids is partially mediated by endocannabinoids 

译名：细菌短链脂肪酸的抗炎作用部分由内源性大麻素介导

期刊：Gut Microbes

IF：10.245

发表时间：2021.11.17

通讯作者：Amrita Vijay

通讯作者单位：英国诺丁汉大学

DOI号：10.1080/19490976.2021.1997559

实验设计

前言

众所周知，运动能引发一种欣快感，也就是跑步者的兴奋感，最近的研究表明，这种兴奋感是内源性大麻素系统激活的结果。内源性大麻素(ECs)，如花生四烯乙醇胺(AEA)、2-花生四烯酸甘油(2-AG)、N-棕榈酰乙醇胺(PEA)和N-油酰乙醇胺(OEA)是脂质介质，可与特定受体结合，引发细胞信号传导。EC系统调节全身能量代谢、炎症、疼痛和大脑生物学，由ECs及其受体组成，最显著的是G蛋白偶联受体CB1、CB2，以及产生和降解ECs的酶。该系统在调节炎症、肌肉力量和能量代谢方面的作用已经在人类和其他哺乳动物中得到了广泛的记录。

此外，有大量证据表明，肠道微生物群和运动相互关联，调节新陈代谢和体内平衡，与饮食无关。具体来说，动物模型和人类研究都表明，运动可以增加产生丁酸的微生物的相对丰度，从而增加丁酸的产生，这是一种具有系统抗炎益处的短链脂肪酸(SCFAs)。另外，肠道微生物群和EC系统也与代谢调节和稳态有关。十多年来，人们已知特定的肠道微生物菌株可以调节肠道细胞中大麻素和μ-阿片类受体的表达。大量的动物模型研究表明，肠道微生物还可以抵消肥胖引起的小鼠结肠EC系统的过度活动，从而降低肠道对脂多糖(LPS)的通透性(即减少代谢性内毒素血症)，并增加脂肪生成。因此，益生元、益生菌和抗生素会影响肠道EC系统。微生物群的这些影响似乎部分是由EC灭活酶的调节介导的，这些酶也代谢非大麻素受体活性的EC相关介质。此外，EC系统的失调与消化系统紊乱有关，如炎症性肠病、肠易激综合征以及肥胖。这些情况包括微生物群失调和短链脂肪酸(SCFAs)水平改变。

到目前为止，肠道微生物产生SCFAs的抗炎作用的机制以及在多大程度上是由EC系统的变化介导或诱导的尚未被探索。此外，人类缺乏特定菌株的变化与因饮食或其他干预措施而产生的EC水平之间的联系。在本研究中，我们在两个队列中研究了ECs和肠道微生物组组成之间的横截面联系，并进一步研究了运动干预后ECs和肠道微生物组变化之间的关系。

结果

队列的描述性特征见表1。使用两个年龄和性别匹配的独立队列，从横截面和纵向评估内源性大麻素与肠道微生物组组成、SCFAs和炎性细胞因子的相关性，如图1所示。

表1 队列的描述性特征。

BMI(身体质量指数)；SCFA(短链脂肪酸)*p<0.05，** p<0.001。p值为基线和随访数据间配对t检验获得的FDR校正值。

 图1 CONSORT流程图。

1 内源性大麻素与肠道微生物组组成、SCFAs和炎症标志物的横断面和可重复性关联

我们首先进行了横断面分析，研究内源性大麻素水平与肠道微生物组组成、短链脂肪酸(SCFAs)和炎症标志物的相关性。我们首先使用纵向队列的基线数据进行了测试，其中我们发现所有四种内源性大麻素与Shannon多样性、SCFA产生菌(双歧杆菌Bifidobacteria和Coprococcus 3)呈正相关，与柯林斯菌(Collinsella)和志贺氏菌(Escherichia Shigella)(一种致病菌)呈负相关(图2)。我们发现内源性大麻素主要是AEA、2AG和内源性大麻素类化合物OEA与丁酸（β(SE)=0.38(0.10), P=0.01)、丙酸（β(SE)=0.31(0.08), P=0.01)和异丁酸(β(SE)=0.34(0.08), P=0.02)显著相关。此外，EC水平与抗炎标志物如IL-10呈正相关，但与一系列促炎细胞因子呈负相关，如图2所示。这些发现随后在一个由年龄和性别匹配的健康个体组成的独立队列中得到验证，我们在其中发现了相似的显著相关性(补充图S1)。通过结合在两个独立队列中观察到的效应方向进行meta分析，我们测试了ECs与上述性状显著关联的可重复性，发现内源性大麻素与Shannon多样性、特定OTUs、SCFAs、促炎标志物和抗炎标志物具有显著的可重复性关联，如图3所示。

图2 矩阵图显示：(a)OTU丰度和短链脂肪酸与内源性大麻素的相关性；(b)促炎标志物和抗炎标志物与内源性大麻素的相关性。关联是基于纵向队列研究的数据。正方形代表beta系数，其大小和颜色根据关联的大小和方向而变化（FDR校正*p<0.05）。

图3 对两个队列横断面分析的95% CIs的beta系数进行meta分析。图中显示了ECs与(a)微生物组组成；(b)短链脂肪酸和(c)促炎和抗炎细胞因子的最强关联。

2 ECs解释了肠道微生物组与炎症标志物关联的比例差异

然后，我们研究了肠道微生物群和肠上皮细胞对与这两个参数显著相关（FDR p<0.05）的炎症标志物的比例效应。我们通过正式的中介来探索这些效应，其中ECs被认为是SCFAs对炎症标志物影响的中介。总的来说，我们发现ECs部分介导了SCFAs和炎症标志物之间的关联。AEA介导33% SCFA(丁酸)对TNFα的影响(P<0.001)和27% SCFA对IL-6的影响(P=0.001)。我们还测试了ECs对炎症标志物的影响有多少是由SCFA介导的，发现56%(P=0.02)和48%(P=0.001)的SCFA分别介导对TNFα和IL-6的影响，如图4所示。

图4 ECs和SCFAs对促炎标志物(TNFα和IL-6)的介导作用。(a)SCFA：丁酸，异丁酸；(b) EC：AEA，PEA。

3 内源性大麻素与肠道微生物组成、SCFAs和炎症标志物及运动反应的纵向关联

本研究发现运动组的AEA、OEA和PEA水平均显著升高，而对照组则没有。同样，我们观察到在运动组中促炎细胞因子显著减少，特定SCFAs显著增加，但在对照组中没有(表1)。然后，我们评估了ECs的变化与微生物组组成、SCFAs和炎症因子的变化之间的相关性。在FDR校正后，单独干预组的相关性并未显示ECs的变化与SCFAs的变化相关(补充图S2)。因此，我们使用来自两组的数据来观察从基线到随访的变化，以观察具有SCFAs和其他标志物的ECs的总体变化效应。结果表明，在ECs中，AEA和OEA的变化与肠道微生物多样性呈正相关(β(SE)=0.32(0.06),P=0.002; 0.44(0.04), P<0.001)。ECs的增加还与双歧杆菌Bifidobacterium(2-AG β(SE)=0.21(0.10), P<0.01；PEA β(SE)=0.23 (0.08),P<0.01)、Coprococcus 3和Faecalibacterium(PEA β(SE)=0.29(0.11), P=0.01; 0.25(0.09), P<0.01)等产生SCFA的细菌丰度增加有关，并且与Collinsella(AEA β(SE)=-0.31(0.12), P=0.004）呈负相关。此外，我们发现AEA与SCFA丁酸正相关(β(SE)=0.34(0.15), P=0.01)。当我们将ECs与细胞因子联系起来时，我们发现2AG和OEA与抗炎标志物(如IL-10)呈正相关，而大多数ECs与一些促炎细胞因子(如TNFα和IL-6)呈负相关(图5)。

图5 矩阵图显示了(a)OTU丰度和短链脂肪酸的变化与内源性大麻素变化的关联；(b)内源性大麻素的变化与促炎和抗炎标志物变化的关联。正方形代表beta系数，其大小和颜色根据关联的大小和方向而变化（FDR校正*p<0.05）。

4 内源性大麻素与基因表达水平的关系

对内源性大麻素与特定大麻素受体以及来自纵向队列的SCFA受体基因表达水平的关系进行了测试。结果发现大多数ECs与一种主要的大麻素受体CNR2呈正相关(所有P<0.05)。有趣的是，AEA和OEA被发现与FFAR2呈正相关，FFAR2是主要的SCFA脂肪酸受体之一(图6)。

图6 热图显示ECs与特定EC和SCFA受体蛋白的基因表达水平呈正相关(浅蓝色)和负相关(深蓝色)(*p<0.05)。

讨论

在这项研究中，我们发现大约三分之一的短链脂肪酸的抗炎下游作用在统计上是由内源性大麻素介导的，但大约三分之二的短链脂肪酸对细胞因子的作用似乎与ECs无关。通过运动干预，我们报告了SCFA产生菌的增加和促炎菌属柯林斯菌(Collinsella)的减少与内源性大麻素循环水平的增加相关。

先前的研究表明，柯林斯菌(Collinsella)丰度的增加与加工食品摄入量的增加和蔬菜摄入量的减少密切相关，而在地中海饮食干预后观察到柯林斯菌丰度下降。此外，还发现该属显著增加了非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的风险，这是最严重的非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)，炎症会导致肝脏损伤，进而发展为肝硬化。此外，已在2型糖尿病患者中检测到柯林斯菌(Collinsella)水平升高，并在一项减肥研究中发现柯林斯菌水平降低，其中胰岛素敏感性在研究过程中有所改善。柯林斯菌(Collinsella)还与炎症细胞计数(即淋巴细胞)呈正相关。在EC水平、Collinsella和细胞因子中观察到的伴随变化表明，该菌属可能通过调节EC系统发挥一些促炎作用，并且鉴于EC调控和胰岛素抵抗之间的紧密联系，该菌属对胰岛素抵抗的某些影响也可能与ECs有关。

到目前为止，还没有任何先前的研究检测EC系统、运动和肠道微生物群之间的潜在联系。在一项针对肥胖和正常体重女性的研究中，中度到剧烈的运动水平不仅在正常体重女性中更高，而且还与较高的OEA和AEA水平相关。研究表明，剧烈的体育运动会增加人体循环AEA水平，但不会增加2-AG水平。两项针对精英橄榄球运动员的研究表明，根据饮食和BMI，与非活动对照组相比，运动员具有更高的微生物多样性和更高的粪便SCFA水平；而另一项研究发现，心肺健康与更高水平的微生物多样性相关，特别是不依赖于饮食产生丁酸的细菌。在使用少量参与者的情况下，一项纵向研究在不改变饮食的情况下对超重女性进行了6周的渐进耐力锻炼，结果发现产生SCFA的细菌增加，这与年龄、体重、脂肪百分比、能量和纤维摄入量无关。因此，我们的数据证实了之前的研究结果，即ECs和SCFAs随运动而增加，并进一步揭示了ECs增加与促炎细胞因子减少之间的强相关性。因此，运动引起的EC基调改善可能会介导肠道微生物群向增加SCFA产生菌的转移，从而在不改变饮食的情况下增加SCFA产量。这是一个需要在受控实验环境中进行检验的假设。

通过正式中介分析(mediation analysis)，我们发现ECs在统计学上介导了三分之一的SCFAs对促炎和抗炎细胞因子循环水平的影响。我们进一步表明，EC水平，特别是AEA和OEA，不仅与EC系统基因如大麻素受体2 (CNR2)呈正相关，而且与SCFA受体FFAR2的更高表达水平呈正相关，但与长链脂肪酸受体FFAR4不相关。这些数据补充了动物模型研究的结果，表明ECs可以减轻中枢和外周炎症，可以调节肠道微生物群组成，降低肠道通透性标志物。与对照组相比，CNR2缺陷小鼠在细菌脂多糖激发后，血清中抗炎细胞因子IL-10水平更高。CNR2的抗炎作用在慢性小鼠动物模型和IBD患者中得到进一步证实。FFAR2被发现对于菊粉诱导的食物摄入量减少和防止饮食引起的肥胖是必要的。总之，我们的数据证实了ECs和SCFAs是肠道菌群对人类代谢和生理影响的重要调节因子。

与之前的研究一致，我们发现内源性大麻素具有抗炎作用，包括2AG和OEA与抗炎标志物(IL-10)呈正相关，而大多数ECs与促炎细胞因子(TNFa和IL-6)呈负相关。同时，我们发现ECs的抗炎作用部分是由SCFAs水平的升高而介导的，特别是丁酸。升高的丁酸水平已被证明通过增加粘蛋白的分泌而降低粘膜渗透性。此外，ECs通过增强紧密连接蛋白(occludin-1)的产生，以及降低claudin-1(作为细胞外屏障)的表达，在调节肠道通透性方面发挥重要作用。虽然还需要进一步的体内和体外研究来阐明相关的具体途径，但我们认为EC系统和肠道微生物群在调节炎症状态中共同发挥作用。

本研究有许多优点。首先，我们的研究结果通过揭示ECs、SCFAs和炎症系统标志物之间的相互作用，巩固了之前关于EC系统和微生物群之间相互作用的知识，并补充了之前的文献。其次，我们已经在一个独立的队列中验证了ECs和细菌丰度之间的横断面关联，并且我们已经使用基因表达数据来注释相关的通路。最后，我们从横向和纵向上评估了ECs、SCFAs和细胞因子之间的关系，并表明简单的生活方式干预(如运动)，可以通过SCFAs和ECs调节炎症标志物。

我们也注意到本研究的一些局限性。我们使用的转录组分析不包括FFAR1和FFAR3的探针，也不包括CNR1，因此我们的基因表达数据仅提供部分信息。我们进行的运动干预是在膝骨关节炎疼痛的个体中进行的，可能与其他组没有直接关系。而ECs、SCFAs和细胞因子之间的相关性在一个健康年龄和性别匹配的较小队列中得到验证，这表明我们的数据是可推广的。从正式中介分析提出的结果是纯统计意义上的，并没有表明因果关系。

总之，在本研究中，我们表明ECs的循环水平始终与较高水平的SCFAs、较高的微生物群落多样性和较低水平的促炎菌属Collinsella相关。我们的统计还表明，高达三分之一的SCFAs的抗炎作用是由EC系统介导的。