UNG酶在PCR实验中的防止假阳性的应用

聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术由美国Cetus公司K.Mullis博士于1983年建立，它是一个能在试管内模仿细胞内核酸复制过程，也就是能在体外特异性扩增一段特定核酸序列的技术。PCR技术使生命科学领域和研究手段发生了革命性的变化，与DNA克隆、DNA重组、DNA测序、RNA干扰等分子生物学技术一样，成为生物学和医学科学研究领域乃至临床疾病诊断不可缺少的工具。但PCR 方法非常敏感，实验室污染在阴性对照甚至空白对照中会出现假阳性的情况，使实验者无法对结果进行判断^[1] 。

PCR实验室污染原因可总结为以上4个，其中标本间交叉污染、PCR试剂的污染、PCR实验室克隆质粒的污染，都可以通过规范操作、实验室消毒等办法消除。扩增产物的污染，是PCR反应中最主要的污染问题，因为PCR产物拷贝量大（一般为1013copies/ml),远远高于PCR检测拷贝的上限，所以极微量的PCR产物气溶胶，就可能造成假阳性。而且气溶胶污染不能通过常规消毒消除，另外UV照射的去污染作用对500bp以下片段效果不好，而临床用于检测的PCR扩增片段通常为300bp左右，通风去污耗时较长，容易死角残留，因此UNG酶应运而生。

UNG 酶（Uracil-N-glycosylase，尿嘧啶-N-糖基化酶）可以降解含有脱氧尿嘧啶核苷酸（dU）的双链 DNA或单链 DNA 中的尿嘧啶糖苷键。如果在 PCR 反应体系中以 dUTP 取代 dTTP，使 PCR 产物都是含有dU的DNA链，在 PCR 开始前增加50 ℃的保温步骤 ，UNG 酶即可将反应体系中已有的dU的DNA污染物中的尿嘧啶碱基降解，并在随后变性这步的条件下 DNA 链断裂，消除由于污染DNA产生的扩增，从而保证扩增结果的特异性，准确性。同时 UNG 酶被灭活，不会再降解新扩增的产物 U-DNA。高品质的UNG酶可以消除高达108的U-DNA，和热启动Taq酶一同用于建立含有UNG/dUTP防污染的热启动PCR反应系统。由于商品化PCR试剂盒中均以dUTP取代dTTP，所以PCR产物都是含有dU的DNA链。目前这一技术也被广泛应用在新冠核酸检测反应体系中。

UNG 酶是克隆有Ecoli K12 Uracil-N-Glycosylase 基因的大肠杆菌经诱导表达后，再经三次纯化分离出来的重组蛋白，分子量25.66KDa。反应条件：50℃，2分钟；反应buffer:20mM Tris-HCL(PH:8.0);1mM EDTA;1mM DTT。UNG酶的最佳活性温度为50℃，95℃灭活。

中华人民共和国行业标准WS/T 230-2002：临床诊断中聚合酶链反应（RT-PCR）技术的应用，对扩增产物的灭活及污染的处理、UNG酶的防污染作用进行了详细的描述:

另有研究显示，在RT-PCR反应中在不加入 UNG 酶时，阳性对照、样品、阴性对照都有特异性条带，甚至有时候换掉所有的试剂，仍然会出现同样的结果。加了 UNG 酶后，样品、阴性对照的特异性条带消失了^[1]。

另外，造成 PCR 假阳性原因还有很多，要彻底根除 PCR 的假阳性。还需要严格操作和区分操作，如 DNA 提取区域、加 PCR 试剂区域、加模板区域、电泳区域，用的微量移液器也不能混用，另外套式PCR、 Touchdown PCR 等方法也能提高试验的特异性和重复性^[2]，企业可以采用多种技术，指定操作规程，保证检验的准确可靠。

普通Taq酶即使在室温下也有一定的活性，如果不采取措施，再加入PCR试剂的过程中，正式PCR开始前就会有少量扩增，从而增加反应背景，影响PCR定量的精度。而热启动Taq聚合酶经过特殊修饰，其活性部位被封闭，在常温下活性部位不发挥作用，没有聚合酶活性，只有经过95℃10分钟的热启动以后，活性部位的封闭被解除，Taq聚合酶活性恢复，才能开始DNA链的延伸，因此，热启动Taq聚合酶可以最大限度地减少背景信号的生成。