科研 | ISME Journal：两种丰富的口腔共生菌相互作用的机制

编译：微科盟中元，编辑：微科盟茗溪、江舜尧。

导读  

复杂的多菌生物膜群落在自然界中非常丰富，尤其是在人的口腔中，其组成和适应度可以影响健康。虽然在疾病期间对这些菌群的研究是必要和普遍的，但是我们对健康菌斑菌群之间的相互作用却知之甚少。在本研究中，我们描述了健康微生物群落中最丰富的两个物种（副流感嗜血杆菌Haemophilus parainflfluenzae和轻型链球菌Streptococcus mitis）之间的相互作用。我们发现，在体内，副流感嗜血杆菌通常与mitis组链球菌相邻，而且根据微生物组数据，它们也呈正相关。通过比较体外共培养数据和体外显微镜，我们发现这种共培养是密度依赖的，并进一步影响H2O2生产。我们发现，副流感嗜血杆菌对H2O2的反应比相关微生物更冗余、多因素，而且该系统的完整性提高了链球菌的适应能力。我们的结果表明，mitis组链球菌可能是副流感嗜血杆菌体内NAD的来源，并激发副流感嗜血杆菌体外碳利用模式，这与在体内观察到的相似。我们的发现描述了健康龈上菌斑中两个最丰富和最普遍的成员之间的相互作用机制，这有助于他们在体内存活。

论文ID

原名：Mechanisms underlying interactions between two abundant oral commensal bacteria

译名：两种丰富的口腔共生菌相互作用的机制

期刊：The ISME Journal

IF：10.302

发表时间：2021.11.03

通讯作者：Matthew Ramsey

通讯作者单位：美国罗德岛大学

DOI号：10.1038/s41396-021-01141-3

实验设计

结果

1 人龈上菌斑中副流感嗜血杆菌与轻型链球菌及相关链球菌共存

为了确定哪种副流感嗜血杆菌最有可能与人类微生物组项目(HMP)采集的117名受试者的微生物组数据进行交互作用。HMP物种分配的宏基因组数据分析表明，副流感嗜血杆菌是在117名受试者中检测到的一种丰富和普遍的龈上菌斑成员，基于序列，其平均相对丰度为7.6%(图1，表S1)。通过LEfSe分析，我们比较了这些受试者中副流感嗜血杆菌丰度最高的上四分位(n = 29)与其余受试者(n = 88)，以确定哪些物种极有可能与副流感嗜血杆菌共存(图1，图S1)。有趣的是，这表明副流感嗜血杆菌富集的个体具有丰富的链球菌，特别是在mitis组。这些数据促使我们将副流感嗜血杆菌与轻型链球菌（作为mitis组菌群的代表）进行相互作用研究，以研究类群-类群相互作用的机制。

图1 序列丰度数据并预测龈上菌斑中类群之间的相关性。人类微生物组项目(HMP)的龈上菌斑宏基因组数据被用来绘制相关物种的相对丰度和患病率，包括副流感嗜血杆菌（蓝色），几种链球菌和所有剩余的链球菌（灰色）。（右上）根据副流感嗜血杆菌丰度排名前25%的受试者通过LEfSe分析与其余受试者进行比较。显示的是LDA评分≤-3.0的丰富物种。完整数据集在表S1和图S1中。

2 种特异性FISH显示出嗜血杆菌与mitis组其中一个子集频繁的共邻近，并提示一种密度依赖关系

为了确定副流感嗜血杆菌和轻型链球菌的大规模共现是否反映在微米尺度的空间结构中，我们使用荧光原位杂交(FISH)和成像技术分析了这两个类群的组织。在龈上菌斑内，轻型链球菌和相关链球菌是副流感嗜血杆菌微米级环境的常见特征。我们使用FISH探针针对副流感嗜血杆菌和其他嗜血杆菌、轻型链球菌及其近亲属(图S2)，以下称为mitis组物种(包括S. infantis, S. oralis, S. peroris,和 S. pneumoniae；探针特异性详见表S2)。通过观察这些物种，我们发现92%的嗜血杆菌在龈上菌斑内位于mitis组物种的10 μm范围内(图2A，表S2)。嗜血杆菌细胞与最近的mitis组细胞之间的中位距离为1.14 μm。因此，在微米尺度下，大多数的嗜血杆菌细胞与mitis组物种共现。

除了邻近性外，图像还显示了这两个类群之间的密度依赖关系，在mitis组物种密度最高的地区，嗜血杆菌的密度降低了(图2C)。我们通过将每张图像分割成6 μm大的1024块来量化这种密度效应(图2D)，并测量每个块内的mitis组物种、嗜血杆菌和总细菌的密度。随着mitis组所覆盖区域的百分比从0增加到20%左右，嗜血杆菌的平均密度也随之增加(图S3)。至少在一定程度上，这种趋势可能是由于每个菌斑总数量的变化，因为每个类群的密度与菌斑的总密度呈正线性关系。当mitis组的密度增加到20%以上时，嗜血杆菌的平均密度降低，表明mitis组对嗜血杆菌的生长具有密度依赖性的抑制作用。鉴于在体内的龈上菌斑样品的微生物组测序和显微镜成像都表明，嗜血杆菌和mitis组之间存在显著的共现性和共邻近性(图1和2)，确定这些观察结果的机制非常重要。

 图2 嗜血杆菌的分部与体内mitis组链球菌的密度有关。A. 41个视野中37,591个嗜血杆菌细胞到最近的轻型链球菌组细胞的距离直方图（测量边缘）。B. 嗜血杆菌与轻型链球菌组细胞的配对相关性。较轻的线表示相关值的95%置信区间的界限。虚线表示null假设：配对相关性等于1。n = 41个视野。C. 稀疏分布的嗜血杆菌菌斑（青色）。D. 丰度高的轻型链球菌组（品红）和嗜血杆菌菌斑。（i）大多数嗜血杆菌的细胞与最近的轻型链球菌组细胞在几微米之内。一般来说，嗜血杆菌的细胞随机分布于轻型链球菌组中。（ii）嗜血杆菌避开了密度最高的轻型链球菌组。比例尺度表示为10 µm。图像显示Smit651 (mitis组链球菌)和Hpar441(嗜血杆菌)探针的杂交信号；探针序列如表S2所示，附加探针图像如图S2所示。

3 轻型链球菌通过产生H2O2消灭副流感嗜血杆菌

在体外控制条件下同时培养副流感嗜血杆菌和轻型链球菌发现了剂量依赖的相互作用：只有当轻型链球菌的丰度高于副流感嗜血杆菌时，副流感嗜血杆菌会被轻型链球菌杀死。我们使用菌落生物膜模型，在聚碳酸酯膜中分别或同时接种轻型链球菌和副流感嗜血杆菌，并允许生长24 h；然后通过重悬细胞和菌落计数来评估细胞丰度(见方法)。在等密度接种的共培养物中，轻型链球菌将副流感嗜血杆菌的数量(图3)降低了近100倍于接种物密度，表明其有活性杀灭作用。这种效应是剂量依赖的，因为我们观察到，当接种的轻型链球菌相当于副流感嗜血杆菌或比副流感嗜血杆菌大三倍时，副流感嗜血杆菌的生长产量与单培养相比显著降低。然而，当轻型链球菌接种量比副流感嗜血杆菌低10倍时，副流感嗜血杆菌的生长量与单株相比无显著变化。

剂量依赖性杀死副流感嗜血杆菌的机制涉及轻型链球菌H2O2的产生。如果共培养的轻型链球菌缺乏丙酮酸氧化酶(ΔspxB)，因而无法产生H2O2，进而减少了共培养中副流感嗜血杆菌的数量。从图3可以看出，副流感嗜血杆菌与轻型链球菌ΔspxB共培养时的生长产量与单独培养的副流感嗜血杆菌在任何比例下均无显著差异，说明轻型链球菌产生的H2O2对副流感嗜血杆菌具有抑制作用。另外的共培养实验表明，除非用外源性过氧化氢酶预处理(数据未显示)，否则副流感嗜血杆菌不能在pH中和的轻型链球菌上清中生长。进一步证实了H2O2的产生限制了副流感嗜血杆菌在这些条件下的生长，酸的产生不足以抑制副流感嗜血杆菌的生长。因此，我们在离体样本中观察到的轻型链球菌对副流感嗜血杆菌的密度依赖性排斥(图2)可以用H2O2毒性来解释。

虽然轻型链球菌对副流感嗜血杆菌的密度依赖性杀灭暗示了一种拮抗作用，但副流感嗜血杆菌的存在提高了轻型链球菌在生物膜共培养中的生长量(图S4)。当轻型链球菌与副流感嗜血杆菌ΔoxyR共培养时，这种增强作用被消除，单与其他过氧化氢酶或细胞色素过氧化物酶突变体单独或联合培养时则没有这种增强作用(图S4A)。添加外源过氧化氢酶提高了轻型链球菌单培养产量，与未添加过氧化氢酶的共培养产量接近，这表明H2O2解毒是提高产量的主要原因(图S4B)。然而，在添加外源过氧化氢酶的副流感嗜血杆菌共培养中，产量仍可提高10倍，这表明进一步的相互作用有利于轻型链球菌的适应性。H2O2分解的作用提高了轻型链球菌的产量，进一步证实当比较轻型链球菌与其ΔspxB突变体的单培养和共培养时，与野生型相比，突变体在单培养和共培养中表现出更高的产量，共培养产量略有增加(图S4C)，这让人想起了野生型与外源过氧化氢酶共培养。

图3 轻型链球菌产生的H2O2以剂量依赖性的方式抑制副流感嗜血杆菌的生长。副流感嗜血杆菌(Hp) CFU在单胞菌和与野生型(Sm)或丙酮酸氧化酶突变体(ΔspxB)共培养的轻型链球菌中的计数。Hp的初始接种量为10 μL, OD600为1，对应为4.65×106 CFU/ml。野生型(Sm)和轻型链球菌ΔspxB的初始接种量为10 μL, OD600分别为0.1、1或3，对应平均为2.45×105、1.55×106或3.45×106 CFU/ml。数据是CFU计数的平均值，误差棒为n≥3的标准偏差。 *表示p＜0.001（使用Student’s t test与单一培养进行比较）。

4 单独的H2O2敏感基因不影响副流感嗜血杆菌与轻型链球菌共培养的适应度

在天然菌斑中，大多数副流感嗜血杆菌细胞几微米范围内出现的轻型链球菌表明，由轻型链球菌分泌的H2O2和其他抑制或促进化合物可以合理地预计会灌注大多数副流感嗜血杆菌生长的底物。我们通过构建基因缺失，并评估缺失菌株在H2O2暴露后的适应度，研究了已知的H2O2相关基因产物在副流感嗜血杆菌中的生长效应。副流感嗜血杆菌中与过氧化物代谢相关的基因包括oxyR，其基因产物是一个对H2O2反应的全球性转录调控因子。在流感嗜血杆菌中，单一过氧化氢酶(katA)是抵抗H2O2的关键。此外，副流感嗜血杆菌具有细胞色素c过氧化物酶(ccp)，其同源性对其他巴氏杆菌（Pasteurellaceae）、空肠弯曲杆菌（Campylobacter jejuni）和流感嗜血杆菌（H. inflfluenzae）的过氧化物抗性很重要。我们还缺失了过氧化物还蛋白(prx)、过氧化物还蛋白-谷氨酸还蛋白(pdgX)和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(g6p)基因，这些基因在流感嗜血杆菌和其他物种中参与氧化应激保护。

我们量化耐过氧化氢变化区域的抑制试验(图4)，将接种了野生型或缺失株副流感嗜血杆菌的琼脂平板暴露在一个饱和H2O2的小过滤器中，以抑制区的直径测量灵敏度。正如预期的那样，敏感性增加最大的是缺失对H2O2的反应性转录调节因子ΔoxyR的副流感嗜血杆菌，而其他所有个体基因缺失突变体对H2O2的敏感性较低。与单个突变体相比，ΔkatA + Δccp双突变体的敏感性显著增加，表明这些基因产物的组合效应。令人惊讶的是，许多突变体的MIC浓度与野生型相同(表S3)，这表明这些基因对H2O2耐受性的个体贡献很小。接下来，我们使用菌落生物膜模型来测试每个突变体与产生H2O2的轻型链球菌共培养的适应度(图4B)。在共培养中，OxyR被证明是副流感嗜血杆菌存活的必要条件，而通常由OxyR控制的单个基因的缺失与野生型相比没有显著差异，这与流感嗜血杆菌(katA)和其他物种的类似突变体形成了巨大对比。然而，ΔkatA + Δccp突变体在轻型链球菌共培养中生长量再次被显著抑制，表明这些基因产物对H2O2抗性具有相加作用。ΔkatA和ΔoxyR突变体也在另一株副流感嗜血杆菌的口腔分离株中产生，在H2O2敏感性方面也表现出类似的趋势(图S5)。这些数据表明副流感嗜血杆菌抵抗H2O2的机制涉及一个复杂的多因子系统，不同于其他嗜血杆菌。

图4 副流感嗜血杆菌对H2O2的抗性依赖于多个基因的贡献。我们评估了野生型副流感嗜血杆菌(WT)对H2O2或与轻型链球菌共培养产量的敏感性，与缺乏oxyR、过氧化氢酶(katA)、细胞色素c过氧化物酶(ccp)、过氧化物还蛋白(prx)、过氧化物还蛋白-谷氨酸还蛋白(pdgX)、饥饿细胞DNA结合蛋白(dps)和葡萄糖- 6-磷酸脱氢酶(g6p)的突变体进行比较。A. 在暴露于30% H2O2的24 h后，测量了抑制区域(没有可见副流感嗜血杆菌生长的区域)，并计算出与野生型相比的倍数变化。数据是相对于WT的平均倍数变化。误差棒表示n≥3时的标准偏差。所有菌株均与WT有显著性差异，ΔkatA-Δccp与ΔkatA有显著性差异(padj＜0.05)，采用带Bonferroni校正的t检验。B. WT和突变的副流感嗜血杆菌CFU与轻型链球菌共培养24 h。副流感嗜血杆菌接种量为4.65×106 CFU/ml。轻型链球菌接种量为2.45×105 CFU/ml。数据用平均CFU表示，误差棒表示n≥3的标准偏差。*表示p＜0.05（Student’s t test与单一培养进行比较）。

5 轻型链球菌和其他链球菌支持副流感嗜血杆菌的生长

与其他嗜血杆菌一样，副流感嗜血杆菌是一种NAD营养缺陷菌，必须从宿主或其他微生物中获得NAD、烟酰胺单核苷酸(NMN)或烟酰胺核苷(NR)。我们发现，除非添加NAD(数据未显示)，否则人类唾液无法支持副流感嗜血杆菌的生长，这表明口腔内邻近微生物是副流感嗜血杆菌NAD的来源。由于棒状杆菌和链球菌是龈上菌斑中最丰富的两个属，我们测试了这些属的物种是否能补充NAD缺陷。在缺乏NAD的培养基上对副流感嗜血杆菌进行的现场检测表明，副流感嗜血杆菌在邻近的轻型链球菌和血链球菌处生长旺盛，但没有其他类群(图5)。这些数据表明副流感嗜血杆菌从这些类群中获得NAD。值得注意的是，在微生物组数据中与副流感嗜血杆菌显著相关的多个物种(图1)，与其他链球菌相比，在没有NAD的情况下，其生长也最为强劲。在另外两种口腔副流感嗜血杆菌分离株中也观察到类似的结果(图S6)。

 图5 链球菌产生的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)支持副流感嗜血杆菌的生长。将S. mitis, S. sanguinis, S. gordonii, S. cristatus, Corynebacterium matruchotii 和C. durum的培养物培养过夜，根据光密度标准化，然后在无NAD的固体琼脂培养基上散布副流感嗜血杆菌，将其斑点化到纸盘上。观察前培养皿孵育48 h。圆盘附近的环表明副流感嗜血杆菌生长。NAD被添加为阳性对照(NAD+)。

6 副流感嗜血杆菌对轻型链球菌的体外转录反应

副流感嗜血杆菌与轻型链球菌有氧共培养的转录组分析表明，副流感嗜血杆菌对氧化应激有多方面的反应。我们观察到，与单培养相比，在共培养中副流感嗜血杆菌的387个基因显著差异表达超过2倍(附录1，图S7)。令人惊讶的是，差异表达的基因并不包括过氧化氢酶；然而，基于转录本丰度，过氧化氢酶在两种条件下都能很好地表达。在通常参与氧化应激反应的基因中，编码铁隔离蛋白的dps在共培养中增加了2.2倍，这表明副流感杆菌正在隔离细胞内的游离铁，以防止氧化损伤。然而，令人惊讶的是，其他几个与H2O2相关的基因，包括ccp、pdgX、硫氧还蛋白(trxA)、谷氧还蛋白(grx)和硫醇过氧化物酶(tsa)在共培养中都受到了抑制，这表明了该物种氧化应激反应的复杂性。副流感嗜血杆菌的应激反应在共培养中被诱导，可能是由于轻型链球菌引起的H2O2相关损伤。我们观察到hfq伴侣编码基因、通用应激蛋白E (uspE)和lexA适度但显著的上调。LexA参与抑制参与大肠杆菌SOS反应的基因。Hfq与许多物种的胁迫反应有关。众所周知，包括uspE在内的通用应激蛋白的副链与DNA损伤反应有关。在共培养中也诱导了可能参与DNA修复的基因，包括编码DNA连接酶、外脱氧核糖核酸酶V链和内切酶V的基因。

众所周知，链球菌能快速消耗碳水化合物，转录数据表明，共培养的副流感嗜血杆菌从碳水化合物的消耗转向碳和能量的替代来源。基因表达增加，表明甘油磷脂的分解导致甘油的摄取和利用，包括预测的细胞外patatin-like磷脂酶(2.5倍)，溶血磷脂酶L2(3.8倍)，甘油摄取促进蛋白(5.3倍)，甘油激酶(3.4倍)，脂肪酸降解调节剂(2.1倍)。此外，果糖1,6二磷酸酶的表达增加了2.8倍，表明有活性的糖新生，这与副流感嗜血杆菌在3-碳中间体（如甘油上）的生长一致。SHS科唾液酸转运体(2倍)、唾液酸利用调节剂(3.6倍)、N -乙酰神经氨酸裂解酶(2倍)、N -乙酰甘露胺激酶(3.8倍)和N -乙酰甘露胺-6-磷酸2-异丙基酶(3.1倍)的表达增加表明唾液酸、N -乙酰神经氨酸的摄取和分解代谢。最后，参与寡肽转运系统的基因表达增加，oppA(3倍)、oppB(2.2倍)、oppC(2.3倍)、oppD(2.7倍)和oppF(2.4倍)。这些数据表明共培养中吸收了替代的碳和能源。轻型链球菌对副流感嗜血杆菌的转录反应是另一项研究的重点。

7 副流感嗜血杆菌的体内和体外转录反应

我们假设，副流感嗜血杆菌在体内的基因表达在很大程度上受到轻型链球菌的影响，因为它们在体内接近(图2)，我们的体外共培养数据可能可以预测副流感嗜血杆菌在体内的行为。为了获得定量数据，我们比较了体外副流感嗜血杆菌转录组和健康牙菌斑的两个单独的体内宏转录组数据集。我们将宏转录组与副流感嗜血杆菌基因组进行了比对，生成了复杂菌斑生物膜内副流感嗜血杆菌转录数据集。然后我们将这些样本与体外单培养进行比较，然后确定哪些在体内表达差异的基因也在体外共培养中表达。

比较所有3组数据(体外共培养和两种体内宏转录组)共享的显著差异基因表达模式，我们发现18个基因相互上调，包括涉及甘油分解代谢、糖异生和菌毛生物发生的基因(表S4)。我们还观察到22个相互下调的基因，包括与严禁响应、蛋氨酸代谢和皮毛相关的基因(表S5，图6B)。在个体宏转录组比较中，我们发现在体外存在的轻型链球菌中有更多显著差异表达的基因。这包括抑制ccp，参与蛋氨酸代谢的基因，严禁反应，金属运输基因，皮毛，以及参与甘油分解代谢、糖异生、细胞应激、DNA损伤/修复相关途径和肽/寡肽运输的基因的诱导(表S6-S9)。

这些数据表明，副流感嗜血杆菌在菌斑中的转录反应可以在与轻型链球菌体外共培养中重演。体外共培养与体内数据集之间明显缺乏重叠的一点是，在体内观察到涉及乳酸氧化的基因上调。由于大多数链球菌产生乳酸作为代谢最终产物，许多口腔类群已经进化出利用乳酸作为碳源的能力。宏转录组数据表明，副流感嗜血杆菌在体内分解乳酸，这在共培养中没有发生，表明在体内存在进一步的碳源竞争和交叉喂养，而在体外复杂培养基上没有发生。总的来说，这些数据表明，副流感嗜血杆菌对轻型链球菌的体外转录反应存在大量重叠，它们在体内也会发生，因为它们存在的距离很近。

图6 共培养基因表达与宏转录组数据的比较。副流感嗜血杆菌的单一培养和共培养的RNASeq结果（在体外）显示，387个显著差异表达基因(DEG)超过两倍。通过比较Benitez-Paez 2014(Mata 1)和Jorth 2014(Meta 2)的体外单一培养到体内宏转录组序列，我们可以生成两组体内特异性DEGs来确定体外共培养和体内条件下共享的差异显著上调(A)或显著下调(B)的基因。

讨论

我们的发现揭示了多种可能决定两种丰富的口腔共生细菌在体内的空间组织和行为的因素。在口腔生物膜结构和土壤细菌混合群落中，氧气的可用性和分布被假设为决定细菌的空间组织，细菌的呼吸创造了一个减少的环境，使严格厌氧菌在生物膜内部生长。氧气可用性的一个重要方面是一些微生物产生H2O2，这可能是在从口腔到海洋表面的各种环境中抵御入侵或竞争物种的重要机制。此外，营养物质(包括电子供体和辅助因子或营养物质)在类群之间的交换可以决定它们之间的生长和相互作用。在此，我们证明链球菌代谢可能决定自然发生的多物种生物膜的空间组织和选区。

早期定殖链球菌产生H2O2被认为是保护共生生物免受入侵物种侵害的重要机制，并被认为是决定物种组成的重要因素。我们的体外研究结果表明，轻型链球菌可以通过H2O2的产生以剂量依赖的方式抑制或杀死副流感嗜血杆菌。这似乎反映在我们的体内研究中，链球菌似乎排除了高于一定密度的副流感嗜血杆菌。我们认为，这些类群之间的密度依赖相互作用对驱动这个复杂群落的异质性和空间组织非常重要。

鉴于在菌斑样本中嗜血杆菌和产生H2O2的链球菌之间的密切联系，我们研究了副流感嗜血杆菌对H2O2的耐药性机制，并证明在测试的菌株中，它具有高度冗余，多因子氧化应激反应与其他密切相关物种(包括流感嗜血杆菌)有显著差异。我们发现，虽然OxyR的缺失导致了H2O2敏感性的显著增加，但过氧化氢酶或其他提供H2O2抗性的单个基因产物的缺失却没有(图4A，表S3，图S5)，这与过氧化氢酶在流感嗜血杆菌中的重要性形成了直接对比，其缺失导致其无法在高浓度H2O2中存活。链球菌H2O2的产生被认为在体内提供了竞争优势，并提供了共存细菌物种必须忍受的胁迫来源。这种处理链球菌产生的H2O2的能力已经在多种物种中得到证实。鉴于副流感嗜血杆菌与菌斑中的轻型链球菌密切相关，并且它们在口腔的其他部位共现，一个有趣的假设是，这个冗余系统是由副流感嗜血杆菌在多物种生物膜中不断接近H2O2生产者而产生的。评估这个冗余系统的调节是我们小组目前正在进行的调查。我们还注意到，当与H2O2抗性受损的副流感嗜血杆菌菌种共培养时，轻型链球菌的体外适应度降低(图S4)，而当外源H2O2解毒发生时，这种适应度恢复(图S4B)。然而，我们也观察到，当H2O2不是一个表明除H2O2反应之外进一步互利的因素时，副流感嗜血杆菌仍然进一步增加了链球菌的产量。

矛盾的是，副流感嗜血杆菌可以被抑制，但却发现它与轻型链球菌相邻。这可能是由于轻型链球菌能够补充副流感嗜血杆菌的NAD缺陷。我们观察到，大量的菌斑棒状杆菌不能恢复副流感嗜血杆菌的生长，但一些口腔链球菌和轻型链球菌可以(图5)，而宿主唾液不能。也许这解释了为什么92%的副流感嗜血杆菌细胞在体内距离轻型链球菌10 μm以内(图2A)。有趣的是，副流感嗜血杆菌和轻型链球菌不仅在人类口腔的相同部位被发现，而且在鼻咽部的其他部位也被发现为共生菌。因此，链球菌产生的NAD可能是副流感嗜血杆菌在人体不同部位生存和定植能力的重要决定因素。虽然这似乎对副流感嗜血杆菌不利，但考虑到口腔中mitis组链球菌的普遍特性，副流感嗜血杆菌可能由于细胞外NAD的持续可用而进化出这种营养缺陷。有趣的是，NADP也补充了这种缺陷，因为副流感嗜血杆菌具有一种NAD激酶，可以将NADP转化为NAD，反之亦然。这种激酶在我们的共培养条件下没有差异表达。然而，一种NADP特异性谷氨酸氢化酶在共培养中上调了3.1倍(补充)，这表明它可能在低pH防御和氧化应激反应中发挥作用，这正在进一步研究。这些数据让人想起其他案例，在这些案例中，营养缺陷发育提供了广泛的基因组规模代谢模型所证明的适应度优势，以及在大肠杆菌和不动杆菌中产生的人工营养缺陷菌的直接测试，其中，当底物存在时，营养缺陷菌的种类与非营养缺陷菌相比显示出适应度优势可用。此外，在大肠杆菌中人工营养缺陷诱导的交叉喂养使这两种菌株都具有适合性优势。因此，副流感嗜血杆菌可能已经适应于某些链球菌的近距离存在，因为它们产生的NAD/P，但其出口方式尚不清楚。

比较副流感嗜血杆菌体外共培养转录组和体内龈上菌斑宏转录组(图6)，我们观察到类似的碳分解代谢模式，包括从糖的利用向小有机酸和酒精的利用转变，同时在严禁响应中的下调基因，这表明更容易获得肽。鉴于它们在体内的接近程度，极有可能mitis组链球菌是导致这些副流感嗜血杆菌在体内行为的原因，这突出了我们还原主义方法的一个方面，该方法可以唯一解释复杂的多物种体内生物膜的行为。在我们的体外共培养中缺少的一个值得注意的途径是乳酸氧化，这在此前已被证明是通过交叉喂养这种发酵产物而导致链球菌与生物体之间的联合感染的关键。在体内，宏转录组数据显示副流感嗜血杆菌也上调了乳酸氧化基因产物，与单独体外共培养相比，这在更多样化、更具竞争性的天然菌斑环境中是可以预期的。在与轻型链球菌共培养的过程中，流感嗜血杆菌的许多其他基因表达有差异，这表明了额外的应激反应和营养有效性的变化，而这些尚未被研究。

副流感嗜血杆菌和轻型链球菌不仅在龈上菌斑中大量发现，而且在人类口腔的其他部位也大量发现。这两个类群的丰度与健康有关，它们的减少与口腔鳞状细胞癌的发展有关。这两个类群也被证明可以防止口腔病原体牙龈卟啉单胞菌的粘附和附着，并且在属水平上观察到它们的相互接近。因此，对这两个物种之间发生的相互作用机制的进一步研究可以维持它们的存在从而为预防疾病提供见解。总之，有丰富的信息和技术可用来研究复杂的多物种群落的组成、结构和基因表达。然而，这些群落的个体成员之间存在的具体机制很难从广泛的观察方法中辨别出来。通过对口腔中两个高度丰富和普遍的物种的还原方法，我们确定了这些类群如何支持彼此的生长，并决定它们在这种环境中的微米级分布，同时建议在更大的体内群落中使用额外的机制。