提高mRNA稳定性和效率，双重化学修饰解锁mRNA更大潜力

来源 | 生辉 

       从传染病、癌症再到多种罕见疾病等，mRNA 正在多种疾病中展现潜在治疗价值。然而，mRNA 分子不稳定、易降解，通常需要进行加帽、加尾、对 mRNA 天然碱基进行修饰和替换等修饰。比如说，正式上市的两款新冠病毒 mRNA 疫苗中的 mRNA 分子都进行了不同程度的特殊修饰设计。 这些特殊修饰的效果如何？同样也是科学家们需要深入研究和解决的问题。精准定量鉴定 mRNA 修饰位点以及修饰方法是深入分析 mRNA 修饰功能、机理机制的前提，也为提高 mRNA 稳定性和效率提供了新方向。 近日，德国科隆大学 （University of Cologne） 的研究人员提出了一种双重化学修饰 mRNA 的策略，并评估了这些修饰对 mRNA 功能的效果。在研究中，该团队在 mRNA 转录过程中引入了第三对碱基，将非天然核苷酸引入了特异性位点，同时与天然 mRNA 修饰方法相结合。研究发现，经过双重化学修饰的 mRNA 可以形成协同效应，提高 mRNA 的稳定、效率以及蛋白表达等。 国内 mRNA 疗法研发公司深信生物创始人李林鲜博士指出，该团队利用这种方法标记 mRNA，进一步研究了引入人工可修饰核苷酸对 mRNA 的效率、稳定性等性能的影响。  

     “我们研究了这种经化学修饰的 mRNA 在细胞中的稳定性，人工合成的 mRNA 是否可以在细胞中用作高效蛋白质生产的模板，以及化学修饰对翻译成蛋白质的影响”，通讯作者 Stephanie Kath-Schorr 教授说，“研究结果表明，这种新方法对于监测 mRNA 进入细胞的过程，监测和影响其在细胞水平的传播以及信息转录的效率非常有效。” 该研究成果已被 Chemical Science 期刊接收，将于近日正式见刊。本研究由科隆大学有机化学研究所的 Stephanie Kath-Schorr 教授主导，她自 2020 年起开始担任科隆大学化学系教授，其实验室的主要研究方向是核酸化学和化学生物学，包括功能 RNA - 核酸的化学修饰、催化 RNA、非编码 RNA 的功能研究。  

图 | Stephanie Kath-Schorr 实验室团队，左一为 Stephanie Kath-Schorr 教授（来源：limes-institut-bonn） 研究团队称，这种方法有望为开发更有效的 mRNA 疗法开辟新的可能性。

双重化学修饰达到协同效果

       目前，已有多种修饰技术可用于产生更稳定的 mRNA，这些方式大体可以分为 3 大类：用人工合成的非天然核糖核酸替换天然核糖核酸来合成 mRNA；加上 5’帽子、3’ poly (A)“尾巴 “和 UTR （untranslated region） 序列；以及利用特殊的新型制剂技术，有效地保护 mRNA。 其中，用人工合成的非天然核糖核酸替换天然核糖核酸来合成 mRNA 是比较常用的方式之一。在真核生物 mRNA 上的化学修饰，大体可以分为甲基化、假尿嘧啶核苷 (Ψ) 和次黄嘌呤三类。经过研究和产业应用验证，这种方式能够降低 mRNA 固有的免疫原性和不稳定性。比如说，Moderna 和 BioNTech 的 mRNA 疫苗都是利用假尿嘧啶修饰保持 mRNA 的稳定性。  

来源：浙江证券研究所 

       随着 mRNA 疗法的持续火热，学术界和产业界一直在寻找更多能够提高 mRNA 效率和稳定性的修饰方式。而深入分析这些修饰方式对 mRNA 的功能影响，是控制 mRNA 结构、提高其稳定性和翻译活性等的一个重要基础。 为了进一步研究这些化学修饰对 mRNA 的影响，Stephanie Kath-Schorr 团队提出位点特异性插入合成核苷酸和天然碱基修饰方式结合的思路。 在实验中，他们通过在 DNA 到 RNA 的酶促转录过程中引入了第三个碱基对，从而在 3 ' -UTR 插入了人工合成核苷酸，同时结合了 Ψ 和 5mC （甲基化修饰） ，并设计了一系列实验观察、量化和验证 mRNA 的功能。 需要注意的一点是，通过遗传字母表扩展转录 （Genetic alphabet expansion transcription, GENAEXT） 引入合成核苷酸的是建立在此前 Ichiro Hirao 和 Floyd Romesberg 各自团队研究成果基础之上，这两个团队在 2018 年发表研究指出能够高精度、高效转录非自然碱基对。在此基础上，Stephanie Kath-Schorr 进行了改进，他们在长 mRNA 片段中特异性引入功能化的非天然核苷酸。  

       在研究中，科隆大学团队首次在体外合成了具有功能化和蛋白质编码能力的 GENAEXT mRNA，其包括 CP 修饰且能够编码红色荧光报告蛋白 mCherry。 具体来说，包括在 3 ' -UTR 区域插入环丙烯 (cyclopropene，CP) ，对 mRNA 进行了 Ψ 和 5mC 修饰提高其活性，以及引入 5 ' 帽和 3 ' 尾巴修饰。 接下来，经修饰的 mRNA 通过脂质体被转染到哺乳动物细胞内，然后利用逆转录定量 PCR （RT-qPCR） 分析了 mRNA 的水平和 mCherry 报告蛋白的表达，并比较了 CP 修饰的 GENAEXT mRNA 与未经修饰 mRNA 的翻译效率。  

图 | 细胞内 

       GENAEXT mRNA 的跟踪和功能分析 数据显示，经过双重化学修饰方法 （天然碱基修饰与插入 CP 非自然碱基对） 的 mRNA 在细胞内翻译能够产生协同效应，这种合成的 mRNA 能够增加蛋白表达量，同时还提高了转染效率。 此外，CP 修饰的 mRNA 在活细胞中通过逆电子需求的狄尔斯 - 阿尔德反应 （inverse electron-demanded Diels-Alder，iEDDA）加上荧光标记。合成的 mRNA 与四嗪 - 荧光团衍生物发生 iEDDA 后，研究人员可以通过共聚焦荧光显微镜在活细胞中观察到 mRNA，同时还可以对 mRNA 进行时间和空间上的追踪。 iEDDA ： 一类无催化剂的点击反应（环加成反应），具有生物兼容性好、反应专一性高、反应速率较快以及毒性低等优势。 为了评估 mRNA 转染和活细胞点击反应过程中的细胞状态，他们还进行了细胞活性测定。

或将解锁 mRNA 更多潜力

        其实，从 mRNA 序列进入细胞到引导细胞分泌蛋白的过程中，都面临着不小的困难，包括在进入细胞前被无处不在的 RNA 酶水解为核苷酸小分子；以及 mRNA 在细胞内的稳定表达等。 前文提到，用人工合成的非天然核苷酸替换天然核苷酸来合成 mRNA 已经是目前常用的 mRNA 修饰方式之一，同时，通过将向 mRNA 特定片段中引入人工合成的非天然核苷酸以修饰 mRNA 的可行性已被证实。在此次研究中，该团队将两种方式结合，实现了蛋白合成效率和转染效率的提升。 因此，该研究团队认为，他们此次实验的结果表明，使用 GENAEXT 方法将为 mRNA 修饰的研究提供新思路。 “这种方法或将开辟 mRNA 修饰新的可能性 —— 即微调 mRNA 的特性，并通过共价载体系统高效将 mRNA 递送到细胞内”，该团队指出，他们已经通过一系列研究表明，原理上，GENAEXT 方法可以应用于任意长度的 mRNA 序列，通过与四嗪衍生物发生的 iEDDA 点击反应，mRNA 将更具功能化。 另外，该团队表示， 通过在 mRNA 的非翻译区引入人工调节元件，可能会解锁调控 mRNA 翻译水平的潜力 。同时，他们提到，除了可以在细胞实验中附着各种报告基团外，这种方法也有潜力应用于蛋白质体外结合实验中用以鉴定 mRNA 结合蛋白。 此外，对于检测经修饰后 mRNA 的稳定性和表达效率，该团队提出的方法亦将提供新的 “抓手”。目前，科学家已经在定量和高通量两大方向上开发出多种方法，较为常用的包括 通过结合特异性抗体富集、化学小分子 / 化学小分子衍生物富集和特殊性质等高通量测序技术。 对于接下来的计划，该研究团队表示，他们正在开发可以更加有效包装 mRNA 的方式，以更好地保护 mRNA，使其顺利进入细胞。 

论文链接 ： https://pubs.rsc.org/en/content/articlepdf/2022/sc/d2sc00670g