科研 | 中科院深海所（IF：5.491）：深海冷渗口沉积物硫酸盐-甲烷转化附近硫循环的微生物生态学（国人佳作）

编译：微科盟阿Z，编辑：微科盟茗溪、江舜尧。

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导读  

微生物硫酸盐还原主要与深海冷渗口硫酸盐-甲烷过渡区（SMTZ）中的厌氧甲烷氧化和烷烃降解有关。SMTZ附近的微生物如何介导硫循环尚未完全了解。在这项研究中，我们在从中国南海两个冷渗区采集的8个沉积物岩芯中的3个里检测到浅层SMTZ。从3个含SMTZ的岩芯中鉴定出110个代表硫氧化细菌（SOB）和硫还原细菌（SRB）菌株的基因组。在SMTZ上方的层中，SOB主要由Campylobacterota、γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）和α-变形杆菌纲（Alphaproteobacteria）组成，它们可能依赖于氮氧化物和/或氧气来氧化近表面沉积层中的硫化物和硫代硫酸盐。在SMTZ下方的层中，δ-变形杆菌属（deltaproteobacterial）SRB基因组和宏转录组揭示了通过Wood-Ljungdahl途径的CO2固定，硫酸盐还原和固氮用于互养或发酵的生活方式。在系统发育树中，总共68%的宏基因组组装基因组与已知物种不相邻，这表明参与硫循环的细菌具有高度多样性。由于SOB和SRB的大量基因组，我们的研究揭示了可能介导硫代谢和相关碳氮循环的微生物种群，从而揭示了深海环境中复杂的生物地球化学过程。

论文ID

原名：Microbial ecology of sulfur cycling near the sulfate–methane transition of deep-sea cold seep sediments

译名：深海冷渗口沉积物硫酸盐-甲烷转化附近硫循环的微生物生态学

期刊：Environmental Microbiology

IF：5.491

发表时间：2021.10.7

通讯作者：王勇

通讯作者单位：中国科学院深海科学与工程研究所

DOI号：10.1111/1462-2920.15796

实验设计

结果

1 采样点

       2013年，“蛟龙”号潜水器和2018年的遥控潜水器（ROV）进行了5次不同的潜水，分别从2个冷渗区采集了8个长达30 cm的推压岩芯，其中包括站点F（水深：1120-1163 m）和Haiyang4（水深：3005 m）（图S1），在那里观察到即将出现的流体。来自站点F（n = 5；JL、SFP1、SFP2、SFP3和SFP4）的岩芯彼此相邻，JL（距离冷渗口< 10 cm）和SFP3比其他岩芯更靠近冷渗口。在黑色生物膜下收集的SFP2和SFP3显示出强烈的臭鸡蛋气味，表明H2S浓度很高。Haiyang4的采样区（n=3；HYP1、HYP2和HYP3）是一个覆盖着黑色微生物垫的冷渗口（图S1和表S1）。HYP3在冒泡地点取样，而HYP1和HYP2为对照海洋沉积物，没有类似于SFP1和SFP4的渗出液和生物膜。使用拉曼光谱仪在站点F进行现场测量，估计渗出流体中的甲烷浓度约为2.51 mM。生物甲烷是站点F的主要碳源。先前对SFP3地球化学的研究表明，地表以下2-6 cm处有一个非常浅的SMTZ（cmbsf）（图S2A）。我们测量了JL、SFP3和HYP3 3个沉积物岩芯的总有机碳（TOC）和总氮（TN）。TOC远超0.5 wt%，而TN值处于< 0.1 wt%的低水平（图S2B）。

  2 微生物组成概述

       通过16S rRNA基因扩增子测序（表S2），揭示了8个岩芯70层中的微生物群落结构。在门水平上，在所有样本中，变形菌门（Proteobacteria）、广古菌门（Euryarchaeota）、Campylobacterota、暗黑菌门（Atribacteria）和绿弯菌门（Chloroflexi）最为丰富（图S3）。Campylobacterota主要由硫卵菌属（Sulfurovum）组成，是表层潜在的优势SOB（8个核心中的6个）。广古菌门仅在3个岩芯中富集，即HYP3、SFP3和JL。广古菌门几乎全部由ANME构成（图1A），推测其与厌氧甲烷氧化有关。尽管HYP3和SFP3中无可用甲烷和硫酸盐浓度，但可以根据ANME和硫卵菌属相对丰度的变化来估算SMTZ。HYP3和SFP3的拟定SMTZ分别约位于10和8 cmbsf，这与之前在SFP3中检测到的SMTZ一致。JL的SMTZ大约在6到8 cmbsf之间，而JL的两个表层也含有相当比例的ANME（0-2 cmbsf为30.8%，4-6 cmbsf为45.2%）（图1A）。在3个岩芯（HYP3、JL和SFP3）中，来自ANME以及common SOB和SRB的成员在潜在SMTZ相邻的大多数层中占据了50%以上的群落。我们还在HYP1、SFP1和SFP2中发现了丰富的Campylobacterota，在HYP2和SFP4中发现了暗黑菌门、厚壁菌门和绿弯菌门（图S3）。我们选择了3个具有潜在浅层SMTZ（高甲烷通量指标）的岩芯样本（HYP3、SFP3和JL）进行后续的宏基因组学研究。从3个岩芯的宏基因组读长预测了16S rRNA基因片段（16S miTags）。与16S rRNA基因扩增子测序显示的微生物群落相比，16S miTags的分类显示沉积物层门水平上的微生物群落相似（图S4）。

       在3个岩芯（HYP3、SFP3和JL；图S5A）中观察到优势群ANME2和SEEP-SRB1之间存在正相关。Common SOB硫卵菌属和Sulfurimonas分别与Cyclobacteriaceae和Candidatus Falkowbacteria呈正相关。3个岩芯的岩芯微生物组由ANME-2a-2b、厌氧绳菌科、硫卵菌属、Sulfurimonas和SEEP-SRB1组成（图S5B）。还发现了少数群体之间一些特定地点相关性，表明不同冷渗区或不同深度的微生物关系存在很大差异。为了评估冷渗岩芯微生物组的新颖性，我们将冷渗沉积物群落与来自不同环境的20多万个微生物群落组成的数据库进行了比较。HYP3、JL和SFP3的所有微生物组新颖性评分（MNSs）均超过0.12，即新颖性的临界值（< 0.12：非新颖；0.12-0.2：新颖；> 0.2：非常新颖）（图S6）。HYP3和SFP3的平均MNS值接近0.2，表明微生物组具有高度的新颖性；JL的平均MNS值接近0.4，MNS最大达到0.48。

  3 微生物功能概况

       为了阐明SMTZ周围微生物介导的元素循环，我们研究了SMTZ承载岩芯SFP3、JL和HYP3的宏基因组。获得了3个岩芯17个冷渗沉积物层的约208 Gbp宏基因组数据（表S3）。在这些岩芯的宏基因组中检测到与甲烷氧化（mcrABG）、硫代谢（dsrAB和fccAB）和反硝化（narG、nirS、nirK、norBC和nosZ）相关的功能基因的分布和相对丰度。计算了每百万映射（GPM）读长的基因数，作为对不同层和位点的17个宏基因组中基因丰度的估计值（图1B和表S4）。编码厌氧甲烷氧化和硫酸盐还原的基因在预测的SMTZ下层中大量存在，而硫化物、硫代硫酸盐和硝酸盐氧化的基因则呈相反趋势。在HYP3中，厌氧甲烷氧化和硫代硫酸盐氧化在10和16 cmbsf之间呈负相关，而硫代硫酸盐氧化和硝酸盐还原呈正相关（图1B）。在JL的6到8 cmbsf之间也发现了类似的趋势。在SFP3中，甲烷氧化基因在6-8 cmbsf层中仍处于较高水平，硫氧化和反硝化基因在0-2 cmbsf层中富集。这些基因丰度的相关性与浅层SMTZ的预测一致。

图1. ANME、SRB、SOB和功能基因的垂直分布。A，JL、HYP3和SFP3沉积物岩芯中参与硫和甲烷代谢的潜在微生物类群分类。通过16S rRNA基因扩增子的聚类和分类学分选，从鉴定的类群中选择ANME、SRB和SOB，计算它们在微生物群落中的相对丰度。B，以每百万宏基因组读长（GPM）的基因数量表示的含SMTZ沉积物岩芯中关键功能基因的分布。

  4 识别潜在SOB和SRB

       组装和装箱共产生395个宏基因组组装基因组（MAGs）（完整性> 50%，污染< 10%）（表S5）。高质量MAGs（完整性> 90%，污染< 5%）占MAGs的5.32%。它们隶属于43个已知门（图S7），1个由6个MAGs组成的未知细菌门和一个由4个MAGs代表的未知古菌门（表S5）。新的门还包括UPB7和EX4484-52。

       在这些MAGs中，SOB和SRB菌株的MAGs是通过至少存在一个硫代谢功能基因（dsrAB、soxABCDXYZ、sqr、fccAB）来预测的。共获得SOB（n = 41）株和SRB（n = 69）株的110个MAGs。SOB菌株的MAGs可分为3个门，主要由γ-变形菌纲SZUA-229（n = 8）、黄单胞菌目（Xanthomonadales） SZUA-36（n=6）和Sulfurovacae（n=5）组成。优势SRB菌株Desulfatiglandales NaphS2（n = 14）、脱硫杆菌目（Desulfobacterales）UBA2156（n=12）和Dissulfuribacterales UBA3076（n = 9），均属于δ-变形菌纲。利用这些SOB和SRB MAGs聚类成76种，与从冷渗口、热液喷口和其他环境中获得的最近亲缘物构建系统基因组树（图2），以证明其生态位特异性。隶属于Campylobacterota和α-变形杆菌纲的SOB均与已知物种相邻。相比之下，对于Gammaprotobacterial SOB，本研究中31个MAGs中有19个与树中的任何已知物种都不接近，这超过了我们所有SOB MAGs的一半（46.34%）（图2）。除了α-变形杆菌纲SOB外，源自热液喷口的MAGs分散在不同的进化枝中，所有这些进化枝中都有冷渗亲属作为树的近邻。SRB中至少有4个系统发育进化枝，其中分布着SEEP-SRB1a、SEEP-SRB1c、SEEP-SRB2和SEEP-SRB 4个物种（图2）。SEEP-SRB1c的相邻进化枝由烷烃降解菌Desulfoccus oleovorans和芳烃降解菌Desusfobacula toluolica组成，均使用硫酸盐作为电子受体。由Syntrophobacter fumaroxidans组成的进化枝没有代表性的SRB基因组，可能是由能够发酵有机分子如芳香族化合物、脂肪酸和丙酸盐以产生CO2和H2的SRB形成的，例如进化枝中的Desufarculus baarsii和Desofatiglans anilini。大多数SRB MAGs（n = 56；81.16%）与系统发育树中的已知SRB物种无关。

       在3个岩芯中，根据映射到MAGs的宏基因组读长百分比（表S5）来估计SOB和SRB的分布。γ-变形菌纲SZUA-229的MAGs从JL岩芯表层沉积物（0-6 cmbsf）的宏基因组中高度恢复，而在HYP3岩芯表层（0-10 cmbsf）中大量发现作为替代SOB的黄色单胞菌目（Xanthomonadales）SZUA-36（图3A和B）。因此，我们的数据显示，在我们的宏基因组中有新的SOB和SRB MAGs（~68.18%），他们在采样点的分布也不同。

 图2. 代表硫循环细菌的冷渗MAGs系统基因组分析。总共选取76个SOB和SRB MAGs（平均核苷酸一致性（ANI）< 95%)构建系统发育树，其中参考基因组从NCBI和NODE数据库下载。本研究中的MAGs用红色星号标记。冷渗和热液喷口的MAGs分别显示为紫色和浅棕色。总共使用43个普遍保守蛋白建立基于1000次重复树的最大似然，自举值以进化枝上点的大小表示。

  5 已鉴定的SOB和SRB的代谢潜能

       我们通过获得的功能基因注释和SOB和SRB MAGs的分布，进一步研究了沉积物中的代谢潜力（图3C和表S6）。22%的SOB MAGs中存在用于CO2固定的还原性磷酸戊糖循环（rPP）途径中的cbbL和/或prk基因；SRB可能依赖于Wood-Ljungdahl途径进行自养合成，因为33%的MAGs含有功能基因（acsAB）。几乎所有MAGs中都没有还原性三羧酸循环（rTCA）途径所必需的aclAB基因，这表明rTCA不用于碳固定。固氮基因存在于脱硫杆菌目MAGs中，在其他SRB和所有SOB MAGs中很少发现。硝酸盐可通过细胞质硝酸还原酶Nar复合物或周质Nap复合物还原。narGH基因仅在2个SRB MAGs和5个SOB MAGs中鉴定；napAB基因存在于两个SRB MAGs和13个SOB MAGs中。此外，35.7%的SOB MAGs含有硝酸还原酶基因。对于那些缺乏硝酸还原酶基因的，我们发现了亚硝酸盐和一氧化氮还原基因，包括nirS、norB和norC基因（图3C）。考虑到aprAB和sat基因，69个SRB MAGs中有60个至少含有一个硫还原功能基因。缺乏这些基因的9个MAGs中有3个来自Desulfatiglandales。没有SRB MAGs包含编码进行硫代硫酸盐氧化的Sox复合物的基因，而大多数SOB MAGs（40/41）含有sox基因和/或硫化物氧化基因（fccAB和/或sqr）。根据MAGs中的基因总结了碳、氮和硫循环的代谢（图3C），分别得出7个SOB和5个SRB代表性模型（图4）。

图3. 从冷渗沉积物中提取的SRB和SOB的基因组特征和代谢潜力。MAGs代表11个SRB和8个SOB组，括号中显示每组MAGs的数量。拥有一个MAG的组被合并为“其他组”。MAGs的详细信息见表S5。颜色梯度被指定为完整性、污染、基因组大小和相对进化差异（RED）值(A)；17个宏基因组中的MAGs招募到的映射读长相对丰度（B）。实心点表示MAGs中存在关键基因（C）。WL：Wood-Ljungdahl通路；rPP：还原性磷酸戊糖循环；AA：乙酸同化；NF：固氮；DN：反硝化；SR：硫还原；TO：硫代硫酸盐氧化；SO：硫化物氧化。

图4. SRB和SOB的代表性碳、氮和硫代谢模型。根据图3C所示的基因对代谢模型进行总结。黄色和绿色背景标记的微生物群分别属于SOB和SRB。箭头表示假设的氮和硫循环以及微生物进行的碳固定过程。虚线箭头表示不完整的通路。MAGs中关键基因的数量列在表S6中。

  6 SRB和SOB的原位代谢活性

       用JL的4个转录组检测SRB和SOB的转录水平。比较了SMTZ上下层之间的碳、氮和硫代谢关键基因的百万分转录本（TPM）读长（图5和表S7）。编码用于乙酸同化的Acs基因在岩芯中高表达（TPM值> 1000高于SMTZ），并且在SMTZ上方的层中明显更丰富（Benjamini-Hochberg检验；q < 0.05）。在SMTZ以下的沉积物中，固氮基因（nifHK）和异化硫酸盐还原基因（dsrAB）的转录本显著富集（Benjamini-Hochberg检验；q < 10-15）。相比之下，与低于SMTZ的层相比，编码硝酸盐和亚硝酸盐还原酶以及硫化物氧化酶的基因在SMTZ以上的表达水平明显更高（Benjamini-Hochberg试验；q < 10-3）。

图5. 功能基因的转录水平。计算了参与碳、氮和硫代谢的关键基因的每百万（TPM）转录本，并在SMTZ上下层之间进行了比较。q值基于Fisher的精确检验，并由Benjamini-Hochberg FDR使用STAMP进行校正。关键基因的注释通过GhostKOALA以默认参数完成。基因的缩写见表S7。

讨论

       在本研究中，我们在深海冷渗沉积物中获得了大量SRB和SOB MAGs（n = 110），以解释它们在浅层SMTZ岩芯中的作用。ROV和载人潜水器的应用允许对活动喷口进行精确取样，并随后检测浅层SMTZ。缺乏ANME和SOB的沉积物岩芯可能是从甲烷通量较低的地点和深度收集的，在本研究中作为对照。南海北部3个含SMTZ岩芯的高微生物组新颖性表明，这些位置具有独特的地球化学环境。特别是，JL冷渗沉积物样本的评分比微生物组新颖性阈值高出3倍。我们还发现，这3个核心含有不同的优势SRB和SOB群，这可能是由于在不同但尚未确定的微环境中的选择和适应。冷渗和热液喷口中类似的硫化氢丰度导致了SOB的生物地理联系，因为在冷渗和热液喷口中都发现了γ-变形菌纲和Campylobacterota的一些SOB。在这项研究中，我们在中国南海的冷渗岩芯中发现了新的SRB物种，这扩大了我们对冷渗口作为具有高度生物多样性的SRB库的理解。除了已知的ANME相关SRB外，这些冷渗沉积物中可能存在自由生活的化能无机自养性和异养性SRB。据报道，SRB可以使用硫酸盐作为电子受体降解有机物，如油降解菌Sulfurospirillum cavolei和栖息在冷渗中的丙烷和丁烷降解菌。

       通过对110个SRB和SOB MAGs中功能基因的预测，我们提出了一个可能的微生物网络，介导元素在ANME、SOB和SRB之间围绕SMTZ循环（图6）。预计部分SRB能够接受AOM产生的电子以完成硫酸盐还原。在SRB中，异化硫酸盐和硫代硫酸盐还原可导致大量硫化氢产生。一些SRB也可能利用来自ANME的电子来完成固氮代谢途径。在本研究中，作为必需固氮基因之一的nifH基因存在于隶属于Dissulfuribacterales和Desulfobulbales的9个SRB MAGs中，这与先前关于SRB中固氮发生的研究结果一致。其他SRB可以从反硝化过程中获得氮源（图4）。SRB中通过Wood-Ljungdahl途径潜在的CO2固定可能产生过量的乙酸盐。在SMTZ以上的层中，乙酸盐可能被同化，这可以由存在大量编码醋酸激酶和乙酰辅酶a合成酶的ackA和acs基因表明，这2个基因分别能够催化我们的SOB MAGs和转录组中乙酰辅酶A和乙酸盐之间的双向转化。因此，乙酸盐和硫化氢可能是SRB产生的物质，并向上转移以促进包括SOB在内的表层沉积物群落的繁荣。

图6. 冷渗SRB和SOB介导的元素循环示意图。SOB的硫氧化反应主要发生在冷渗沉积物SMTZ上方，而SMTZ下方的SRB进行硫还原反应，甲烷的厌氧氧化同时发生。

       我们的宏基因组学和宏转录组学数据显示，SOB可能是在冷渗沉积物中进行硫氧化、乙酸盐同化和碳固定的关键角色。在表层，硝酸盐还原与SOB中的硫氧化有关，这可能将硫化氢、元素硫和硫代硫酸盐氧化成硫酸盐。我们还观察到napAB基因的高表达水平，作为SOB中硝酸盐还原和硫氧化之间联系的证据。或者，napAB基因可能参与某些异养生物的好氧反硝化作用，以消耗NADH池。在这项研究中，并非所有的SOB MAGs都含有硝酸盐或亚硝酸盐还原基因。也许，一些靠近海底的α-变形杆菌纲SOB可能将氧用作电子受体，正如在系统发育树中鉴定出与好氧二甲基硫化物氧化菌Hyphomicrobium sulfonivorans密切相关的物种所表明的那样。采样点的不同微环境，特别是氧气和硝酸盐通量，可能有助于解释主要SOB参与者的差异（JL：γ-变形菌纲，SZUA-229；SFP3：Sulfurovaceae；HYP3：黄单胞菌目）。

       在本研究中，在SOB MAG中编码了2组用于硫化氢氧化的酶，硫化物-醌氧化还原酶（SQR）和黄素细胞色素c（FccAB）。在周质空间中，硫化氢被SQR酶氧化为多硫化物，或被光合和化能无机自养性硫氧化γ-变形杆菌纲编码的FccAB酶氧化为零价硫。SQR酶依靠泛醌运输电子并参与有氧呼吸，提供产生ATP和生成多硫化物的能量。因此，SQR对高浓度硫化物具有更高的亲和力和更高的节能效果。在SMTZ的上层，沉积物并非严格厌氧，SOB MAGs鉴定了与氧的亲和力不同的末端氧化酶cbb3或aa3相关的氧化呼吸链。因此，冷渗沉积物中的SOB基团可能维持两条硫化物氧化途径。在含氧高硫化物区，SQR酶促进硫化氢氧化；在低氧和低硫化物区域，FccAB可用于完成硫氧化。fccB和sqr基因表现出相似的表达水平，证实了宏基因组分析预测的氧依赖性代谢特征。

       SOB中的硫氧化也参与SOX系统（包括蛋白质复合物SoxAX、SoxB、SoxCD和SoxYZ），该系统将细胞周质中的硫化物、亚硫酸盐和硫代硫酸盐氧化为硫酸盐。硫卵菌属和γ-变形菌纲UBA4486可能在SoxCD酶的催化下将硫代硫酸盐氧化为硫酸盐。在其MAGs中存在完整钼辅因子生物合成途径的基因为SoxC提供了辅因子。没有soxCD基因，零价硫是硫代硫酸盐氧化的最终产物。我们发现只有5个SOB MAGs在低转录水平上含有soxC基因，这表明零价硫可能是由大量SOB产生的（图2C）。先前在F站点进行的现场拉曼定量测量显示了大量元素硫。此外，某些变形杆菌中的dsrAB基因可以进行SOB过程，这解释了SZUA152和SZUA229基因在γ-变形菌纲SZUA152和SZUA229的MAGs中dsrAB和soxAB基因的共存及其在SFP3和JL表层的高覆盖率。

       在这项研究中，在SOB MAGs中鉴定的固碳基因可能参与rPP途径中的Rubisco和PEK，它们的高表达表明在冷渗沉积物中SOB可能进行了活性碳固定，如先前在墨西哥湾所报道的。该区域丰富的SOB微生物可能为沉积物表面的贻贝、蛤蜊和蠕虫提供有机物和能源。

结论

       在这项研究中，我们预测了深海冷渗沉积物中SMTZ附近微生物驱动的相关碳、氮和硫元素循环。SOB和SRB可能由代表不同物种的28%的MAGs组成。各种丰富的SOB可回收硫化物并生成硫酸盐，以支持与ANME相关的同养SRB。这将维持浅层SMTZ，并减少甲烷释放到底层水中。因此，这些硫代谢细菌对于控制甲烷等全球变暖气体进入海洋至关重要。这些细菌进行的固氮和硝酸盐还原为营养贫乏的深海沉积物提供了大量氮资源。总之，冷渗口中的SOB和SRB在分类和功能潜力方面都极为不同。