科研 | 浙江大学（IF：7.171）：长期和短期锌失衡对肠道菌群的影响以及锌敏感微生物标志物的筛选（国人佳作）

编译：微科盟繁星，编辑：微科盟茗溪、江舜尧。

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导读  

在世界范围内，锌 (Zn) 失衡是一种常见的单一营养素紊乱疾病，但短期和长期锌失衡对肠道菌群的影响仍不清楚。本研究给3周大的C57BL/6小鼠喂食含锌分别为0 mg/kg（低锌组）、30 mg/kg（对照组）、150 mg/kg（高锌组）和600 mg/kg体重（过量锌组）的膳食，喂养时间持续4周（短期）或8周（长期）。锌剂量差异会导致门水平、属水平和种水平的肠道菌群组成发生变化，如改变了罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri ）和嗜黏蛋白阿克曼菌（Akkermansia muciniphila）的丰度。此外，短期低锌饮食会减少碳水化合物、多糖和核苷酸代谢等途径。长期低锌饮食会抑制戊酸的产生。在4周和8周的喂养期间，高锌和过量锌饮食小鼠的耐药性和传染病易感性增强。长期喂养高剂量锌，会抑制产短链脂肪酸(short-chain fatty acids， SCFAs)微生物的丰度和代谢物浓度。同时，黑色素杆菌(Melainabacteria)（门）和脱硫弧菌属ABHU2SB菌株（Desulfovibrio sp. strain ABHU2SB）（种）被鉴定为可精准反映锌状态的潜在标志物（曲线下面积AUC>0.8）。总的来说，本研究确定了喂养不同剂量和时间的锌对小鼠肠道菌群组成及其代谢物浓度的显著影响，并筛选出锌敏感微生物标志物。

论文ID

原名：Effect of Long-Term and Short-Term Imbalanced Zn Manipulation on Gut Microbiota and Screening for Microbial Markers Sensitive to Zinc Status

译名：长期和短期锌失衡对肠道菌群的影响以及锌敏感微生物标志物的筛选

期刊：Microbiology Spectrum

IF：7.171

发表时间：2021.11.3

通讯作者：冯杰

通讯作者单位：浙江大学动物科学学院动物分子营养学教育部重点实验室

DOI号：10.1128/Spectrum.00483-21

实验设计

前言

       锌几乎是所有生物的必需营养素。世界卫生组织 (WHO) 报告称，世界上至少有30%的人口缺锌，尤其是发展中国家的儿童。缺锌可能导致生长迟缓、性腺机能减退、腹泻或肠病性肢端皮炎 (AE) 。因此，通常在食物、饮料和营养补充剂中为儿童额外添加锌，以满足他们的生理需求。然而，锌的消耗量往往超过公认的营养需求。最近的研究报告称，过量的锌会产生有害后果，如降低免疫功能、影响肠道吸收和分泌能力或增加内脏肥胖。

       过去十年，人类肠道菌群已成为宿主健康状况的主要组成部分。它具有多种重要功能，例如增强免疫力、预防过敏原以及产生SCFAs。膳食锌摄入量的改变可能在肠道菌群群落动态和种间竞争中起主要作用。缺锌可能会增加细菌感染易感性，如流产布鲁氏菌（Brucella abortus）、肠道沙门氏菌（Salmonella enterica） 和空肠弯杆菌（Campylobacter jejuni） 等。但是关于过量的锌如何影响肠道菌群知之甚少。Zackular等人发现，在艰难梭菌（C. difficile）感染的小鼠模型中，过量膳食锌改变了肠道菌群，降低了对艰难梭菌（C. difficile）感染（C. difficile infection，CDI）的抵抗力。截止目前，对于幼龄动物和儿童肠道菌群中不平衡膳食锌的短期或长期疗效知之甚少。关于不平衡膳食锌（短期或长期）对幼年动物和儿童肠道菌群的影响仍不清楚。

       目前，缺乏可靠的、反应灵敏的和特异性的锌生物标志物使锌不平衡的量化和表征十分困难。Lowe及其同事提出，血清、血浆、头发和尿锌是人类32种潜在生物标志物中最可靠的预测因子。然而，准确评估锌的状态十分困难，尤其是在临界不平衡的情况下。宿主的生活方式和行为可以通过人类肠道菌群的变化来反映。此外，膳食金属摄入量是影响菌群组成的最关键因素之一。为了阐明膳食锌与肠道菌群之间的关系，我们从断奶到青春期或成熟期给小鼠饲喂不同剂量的锌，以探讨锌失衡对肠道菌群及其代谢物（SCFAs）的影响，并筛选出对锌敏感的微生物标志物。

结果

1 膳食锌对生长状态和结肠形态的影响

       为了确定不平衡的膳食锌和干预持续时间对断奶小鼠的影响，对实验过程中的生长参数进行监测。在为期4周的锌干预期间（短期锌干预），低锌组（0 mg/kg）的平均日增重和摄食量显著降低（图1A和B）。在为期8周的锌干预期间（长期锌干预），4组的平均日增重接近（图1C）。与对照组（30 mg/kg）相比，低锌组和高锌组（150 mg/kg）的摄食量均显著降低（图1D）。

       远端结肠样本通过H&E染色用来表征锌水平和年龄对结肠形态的影响。在4周低锌组中观察到结肠绒毛轻微脱落（图1E)，8周高锌组可见部分结肠炎性细胞浸润(图1F）。

图1 膳食锌不平衡对不同时期小鼠生长状态和结肠形态的影响。（A）4周锌干预期间的每日体重增加和（B）饲料摄食量（每组n =8）。(C) 8周锌干预期间的每日体重增加和(D)饲料摄食量（每组n =8）。(E) 4周锌干预结肠组织切片的H&E染色图；箭头表示结肠绒毛轻微脱落。(F) 8周锌干预结肠组织切片的H&E染色图；箭头表示结肠炎性细胞浸润。不同字母代表组间具有显著差异（P<0.05）。

  2 膳食锌对肠道菌群多样性的影响

       与对照小鼠相比，添加锌4周或8周的小鼠的肠道菌群结构发生显著变化（图2A和B，表S1）。4周干预组别中，与低锌组相比，过量锌组小鼠的微生物物种显著减少，而Shannon指数没有观察到明显差异 (图2C和E）。在8周干预组别中，4组的微生物物种相似。低锌组和对照锌组的Shannon指数较高，而高锌组的Shannon指数最低（图2D和 F）。

图2 不平衡的膳食锌显著影响肠道菌群。非度量多维缩放 (NMDS)，基于OTU的Bray-Curtis距离。(A) 排序图显示短期0 mg/kg锌干预(SZn0)、短期30 mg/kg锌干预 (SZn30)、短期150 mg/kg锌干预 (SZn150) 和短期600 mg/kg锌干预 (SZn600) 小鼠盲肠菌群的β-多样性。(B) NMDS显示长期0 mg/kg锌干预 (LZn0)、长期30 mg/kg锌干预 (LZn30)、长期150 mg/kg锌干预（LZn150）和长期600 mg/kg锌干预（LZn600）的小鼠肠道菌群之间具有显著差异。（C到F）4周和8周的膳食锌喂养对使用观察物种总数评估的α多样性和Shannon指数的影响。

3 膳食锌对门水平肠道菌群组成的影响

       门水平微生物相对丰度的变化表明短期和长期锌干预对肠道菌群结构的影响。喂养4周的小鼠中，厚壁菌门（Firmicutes）(65.7、72.4、69.7和71.9%)、放线菌门（Actinobacteria）(13.9、13.9、10.7和9%)、疣微菌门（Verrucomicrobia）(0.2、0.3、10.2和5.4%)、变形菌门（Proteobacteria）(2.2、8.7和8.7%))和拟杆菌门（Bacteroidetes）(11.3、9.3、5.2和4.7%)是小鼠盲肠中门水平上最主要的微生物物种，共占97.9%以上（图3A）。高锌膳食和过量锌膳食显著提高了4组小鼠疣微菌门（Verrucomicrobia ）的丰度（图3B)，低锌膳食和过量锌膳食小鼠变形菌门（Proteobacteria）的比例显著高于对照和高锌膳食（图3C）。随着膳食中锌的增加，拟杆菌门（Bacteroidetes）与厚壁菌门（Firmicutes ）的比例下降（图3D）。此外，拟杆菌门（Bacteroidetes）与厚壁菌门（Firmicutes ）的比例和体重呈负相关（图3E）。

       喂养膳食锌8周的组中，厚壁菌门（Firmicutes ）（65.5，60.2，55，和71.2％）、放线菌门（Actinobacteria）（4.5，4.7，21.6，和4.9％）、拟杆菌门（Bacteroidetes）（20.1，20.9，16.6，和17.5％）、变形菌门（Proteobacteria）（3.6，4.5、2.8和3%）、疣微菌门（Verrucomicrobia ）（2.1、1.7、0.56和0.96%）共占总序列的92.4%以上（图3F）。在喂食高锌小鼠中放线菌门（Actinobacteria）丰度最高（图3G）。与补充短期锌相反，喂养膳食锌8周的组别中低锌组疣微菌门（Verrucomicrobia）的比例增加，高锌组疣微菌门（Verrucomicrobia）减少（图3H）。在长期喂养膳食锌的4组中，拟杆菌门（Bacteroidetes）与厚壁菌门（Firmicutes ）的比例无显著差异，且该比值与体重无显著相关性（图3I和J）。

图3 膳食锌对小鼠盲肠门水平微生物群落结构的影响。(A) 短期0 mg/kg锌干预 (SZn0)、短期30 mg/kg锌干预 (SZn30)、短期150 mg/kg锌干预 (SZn150) 和短期600 mg/kg锌干预 (SZn600) 组小鼠中门水平上前10个微生物种群。(B) 喂养4周150 mg/kg和600 mg/kg膳食锌的小鼠疣微菌门（Verrucomicrobia）增加。(C) 喂养缺锌和过量膳食锌小鼠的变形菌门（Proteobacteria）水平明显升高。(D) 在短期干预期间，厚壁菌门（Firmicutes ）/拟杆菌门（Bacteroidetes）与锌剂量呈正相关。(E) 喂养4周膳食锌小鼠肠道厚壁菌门（Firmicutes ）/拟杆菌门（Bacteroidetes）与体重线性相关。(F) 长期0 mg/kg锌干预(LZn0)、长期30 mg/kg锌干预 (LZn30)、长期150 mg/kg锌干预（LZn150）和长期600 mg/kg锌干预（LZn600）组小鼠盲肠中门水平上前10个微生物种群。(G) 长期喂养150 mg/kg膳食锌的小鼠放线菌门（Actinobacteria）水平升高。(H)长期缺锌小鼠疣微菌门（Verrucomicrobia）丰度增加。(I)膳食锌对厚壁菌门（Firmicutes ）/拟杆菌门（Bacteroidetes）比例的影响。(J)喂养8周膳食锌组别中，体重与厚壁菌门（Firmicutes ）/拟杆菌门（Bacteroidetes）比例的相关性分析。不同字母代表组间具有显著差异（P<0.05）。

  4 膳食锌在属水平上对肠道菌群组成的影响

       对优势菌属（前30名）相对丰度的分析揭示了短期和长期锌干预中不同剂量膳食锌对盲肠菌群的影响（图S1）。在短期锌干预组别中，与其他组别相比，短期低锌干预小鼠盲肠内容物中脱硫弧菌（Desulfovibrio）、肠杆菌属（Enterorhabdus）、黄杆菌属（Flavonifractor）、毛螺旋菌属（Parasutterella）、粘螺菌属（Mucispirillum）、另枝菌属（Alistipes）、杆菌属（Odoribacter）和厌氧棍状菌属（Anaerotruncus）的相对丰度增加，鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas）的相对丰度降低（图S1A）。对照组中未鉴定的毛螺菌科（ unidentified Lachnospiraceae）、蓝绿藻菌属（Lachnoclostridium）和双歧杆菌（Bifidobacterium）的相对丰度高于高锌组和过量锌组。

       与短期锌干预相比，长期锌干预逆转了一些细菌分布的改变（图S1B）。低锌干预增加了小鼠盲肠中嗜黏蛋白阿克曼菌（Akkermansia）、布劳特氏菌属（Blautia）、 拟普雷沃菌属（Alloprevotella）和瘤胃梭菌属（Ruminiclostridium） 等微生物的相对丰度。与其他组相比，对照组中毛螺旋菌属（Parasutterella）、螺杆菌（Helicobacter）、杆菌属（Odoribacter）和回肠杆菌（Ileibacterium）的相对丰度较高，杜氏菌属（Dubosiella）、粪杆菌属（Faecalibaculum）和双歧杆菌（Bifidobacterium）的比例较低。与其他长期干预组别相比，高锌干预降低了大多数菌种的相对丰度，但增加了双歧杆菌（Bifidobacterium）和厌氧菌属（Anaeroplasma）的相对丰度。喂食过量锌的小鼠中拟杆菌属（Bacteroides）和肠杆菌属（Intestinimonas）的丰度增加，而乳酸杆菌（Lactobacillus）的丰度减少。

5 膳食锌在种水平上对肠道菌群组成的影响

       进一步在种水平上对细菌群落差异进行分析（前20个物种中潜在的益生菌和致病菌）（图4A和G）。在干预4周的组别中，对照组中罗伊氏乳杆菌（ Lactobacillus reuteri ）和厚壁菌门细菌ASF500（ Firmicutes bacterium ASF500）的丰度显著增加。与对照组相比，过量锌喂养的小鼠中产酸拟杆菌（Bacteroides acidifaciens ）的相对丰度显著降低(图4B到D）。高锌组和过量锌组增加了小鼠盲肠中嗜黏蛋白阿克曼菌（Akkermansia muciniphila）的丰度（图4E）。与其他干预相比，低锌组中肝螺杆菌（Helicobacter hepaticus）发生富集（图4F）。

       在干预8周的组别中，对照锌饮食中罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）的丰度最高，而4组产酸拟杆菌（Bacteroides acidifaciens）的丰度相似（图4H 和I）。低锌组和过量锌组中均发现厚壁菌属细菌ASF500（Firmicutes bacterium ASF500）富集（图4J）。高锌组肝螺杆菌（Helicobacter hepaticus）的丰度高于其他组（图4K）。

图4 膳食锌对小鼠盲肠种水平微生物群落结构的影响。(A) 短期0 mg/kg锌干预 (SZn0)、短期30 mg/kg锌干预 (SZn30)、短期150 mg/kg锌干预 (SZn150) 和短期600 mg/kg锌干预 (SZn600) 组小鼠种水平前20位微生物种群。(B) 短期过量锌组中罗伊氏乳杆菌（ Lactobacillus reuteri ）显著增加。(C) 4周膳食锌干预对厚壁菌属细菌ASF500（Firmicutes bacterium ASF500）相对丰度的影响。(D) 4周短期干预期间，对照组中产酸拟杆菌（Bacteroides acidifaciens ）的相对丰度显著高于低锌组和过量锌组。(E) 高锌组和过量锌组增加了小鼠盲肠中嗜黏蛋白阿克曼菌（Akkermansia muciniphila）的丰度。(F) 对照组小鼠肝螺杆菌（Helicobacter hepaticus）富集。(G) 长期0 mg/kg锌干预 (LZn0)、长期30 mg/kg锌干预 (LZn30)、长期150 mg/kg锌干预（LZn150）和长期600 mg/kg锌干预（LZn600）组小鼠盲肠中种水平上前20个微生物种群。(H) 在8周长期干预组中，喂食30 mg/kg锌小鼠的罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）水平增加。(I)在8周长期干预组中，产酸拟杆菌（Bacteroides acidifaciens）的相对丰度。(J) 低锌组和过量锌组与厚壁菌属细菌ASF500（Firmicutes bacterium ASF500）的富集有关。(K)150 mg/kg锌组肝螺杆菌（Helicobacter hepaticus）丰度增加。不同字母代表有显著性差异（P<0.05）。

6 肠道菌群功能预测

       基于KEGG通路的“人类疾病”和“代谢”功能分析显示，不同膳食锌组之间存在显著差异（图5）。在短期的锌干预中，与人类疾病相关的基因的丰度在高锌组中显著升高，而在对照锌组中的丰度显著降低，这些基因涉及癌症、耐药性、感染性疾病和神经退行性疾病（图5A）。值得注意的是，与物质依赖有关的通路在低锌组和过量锌组中均增加，而在高锌组中减少。碳水化合物代谢、多糖生物合成和代谢、其他氨基酸代谢、萜类化合物和聚酮化合物代谢以及核苷酸代谢水平在低锌组中受到抑制，在高锌组中被激活（图5B）。在低锌组和对照组中观察到的与异生物质生物降解和代谢相关的基因比例高于高锌和过量锌组。

       在长期的锌干预中，高锌喂养的小鼠富含与癌症、耐药性、内分泌和代谢疾病以及传染病相关的人类疾病通路，并抑制了与物质依赖相关的基因（图5C）。与心血管疾病相关的基因在低锌组中的丰度显著较高，而在过量锌组中的丰度较低。在代谢途径方面，氨基酸代谢的相对丰度和其他次生代谢物的生物合成在低锌组显著增加，在高锌组减少（图5D）。喂食高锌饮食的小鼠与碳水化合物代谢、能量代谢和核苷酸代谢相关的基因增加，而与酶家族、脂质代谢、辅因子和维生素代谢以及萜类化合物和聚酮化合物代谢相关的基因减少。对照锌组中异生物质生物降解和代谢基因高于其他组别。

图5 膳食锌对小鼠盲肠中微生物功能的影响。Tax4Fun生成的图显示了基于16S rRNA数据集的肠道菌群功能预测。（A和B）为在4周的锌干预中，膳食锌对与（A）人类疾病和（B）代谢相关的KEGG通路相对丰度的影响。（C和D）在8周的锌干预中，膳食锌对与（C）人类疾病和（D）代谢相关的KEGG通路相对丰度的影响。不同字母代表有显著性差异（P<0.05）。

7 膳食锌对代谢物的影响

       对总代谢物和个体代谢物的分析显示，饮食组之间存在显著差异。在短期锌干预期间，过量锌组的总代谢物水平最低，其次是对照锌组、高锌组和低锌组。有趣的是，总SCFAs、乙酸、丁酸、异丁酸、异戊酸和丙酸中也发现高度类似的结果（图6A）。

       在长期锌干预期间，与低锌组和对照锌组相比，高锌组盲肠总代谢物以及总短链脂肪酸、丁酸、乙酸、异戊酸、异丁酸和丙酸的水平均显著下降。对照组中戊酸浓度最高，其次是高锌组和过量锌组，而低锌组的戊酸浓度最低（图6B）。

       根据锌干预小鼠的数据，我们假设SCFAs受到菌群变化的显著影响。在4周和8周的锌干预期间，肠杆菌属（Enterorhabdus）、另枝菌属（Alistipes）、杆菌属（Odoribacter）、厌氧棍状菌属（Anaerotruncus）、拟杆菌属（Bacteroides）和副拟杆菌（Parabacteroides）等微生物均发生变化，这些微生物都属于产短链脂肪酸菌。因此，通过Spearman相关分析，对优势属和SCFAs（主要是醋酸盐、丙酸盐和丁酸盐）进行相关分析（图6C到D）。值得注意的是，盲肠SCFAs的产生与拟杆菌属（Bacteroides）、 另枝菌属（Alistipes）和副拟杆菌（Parabacteroides）的相对丰度显著相关，这表明本研究中这3个属主要参与了SCFAs的生成。

图6 膳食锌对小鼠盲肠代谢物的影响。（A）4周和（B）8周锌干预对盲肠内容物中的代谢物浓度的影响。(C和D)热图描述了在4周锌干预和8周干预中，菌属与盲肠乙酸、丙酸和丁酸的Spearman相关性。从完全负相关（-0.6，蓝色）到完全正相关（0.6，红色）（*P<0.05；**P<0.01；方差分析）。

  8 基于肠道细菌标记物的锌失衡预测

       为了探究不平衡锌对肠道菌群组成的影响，我们使用相对丰度数据进行线性判别分析效应大小（LEfSe）分析，以确定不同膳食锌处理中具有代表差异的细菌。短期锌干预样本中有55种细菌分类群，长期锌干预样本中有79种细菌分类群（图7A和B)。在门水平上，LEfSe分析确定黑色素杆菌(Melainabacteria)是短期和长期膳食锌干预的一个强区分分类群（图7A到D）。接着对黑色素杆菌(Melainabacteria)和血清锌进行Pearson相关分析（图7E和F）。正如预期，血清锌水平与第4周和第8周黑色素杆菌 (Melainabacteria) 的相对丰度呈负相关（分别为P=0.0002和P=0.0001）。观测者操作特性曲线 (ROC) 分析表明，黑色素杆菌 (Melainabacteria) 可实现对锌水平的高精度鉴定（AUC>0.85，图7G到H）。就属水平而言，在4周和8周的干预中，低锌组的乳酸杆菌（Lactobacillus）更为丰富。在4周的干预中，乳酸杆菌（Lactobacillus）在区分锌缺乏和锌过量（AUC>0.84）方面具有良好的准确性。然而，在8周干预中，乳酸杆菌（Lactobacillus）与血清锌没有显著相关性，AUC仅为0.69（图S2A-F）。LEfSe分析还发现脱硫弧菌属ABHU2SB菌株（Desulfovibrio sp. strain ABHU2SB）对不同的膳食锌水平具有特异性（图7I和J）。

根据Pearson相关分析和ROC曲线，血清锌水平与脱硫弧菌属ABHU2SB菌株（Desulfovibrio sp. strain ABHU2SB）的相对丰度高度相关。在4周（P=0.0037和P=0.0004）和8周的干预中，ROC图AUC值为0.8至0.91（图7K到N）。

图7 基于肠道细菌标志物预测锌不平衡。（A）4周和（B）8周膳食锌干预中，小鼠肠道菌群中确定的分类生物标记物的线性判别分析（LDA）效应大小（LEfSe）图。LEfSe算法强调统计和生物学相关性，用于发现生物标记物。线性判别分析（LDA）评分阈值为3。(C)4周和(D)8周膳食锌干预中，不同组别小鼠黑色素杆菌 (Melainabacteria) 的相对丰度。（E）4周和（F）8周膳食锌干预小鼠黑色素杆菌 (Melainabacteria) 相对丰度与血清锌水平的相关性分析。(G)4周干预期，不同剂量膳食锌喂养小鼠菌群中黑色素杆菌 (Melainabacteria) 的预测。(H)8周干预期，不同剂量膳食锌喂养小鼠菌群中黑色素杆菌 (Melainabacteria) 的预测。（I）4周和（J）8周干预中，不同剂量膳食锌组中脱硫弧菌属ABHU2SB菌株（Desulfovibrio sp. strain ABHU2SB）的相对丰度。（K）4周干预期小鼠的脱硫弧菌ABHU2SB（Desulfovibrio sp. strain ABHU2SB）与血清锌水平的相关性分析。（L）8周干预期小鼠的脱硫弧菌ABHU2SB（Desulfovibrio sp. strain ABHU2SB）与血清锌水平的相关性分析。(M) 4周干预期，不同剂量膳食锌喂养小鼠菌群中脱硫弧菌属ABHU2SB菌株（Desulfovibrio sp. strain ABHU2SB）的预测。(N) 8周干预期，不同剂量膳食锌喂养小鼠菌群中脱硫弧菌属ABHU2SB菌株（Desulfovibrio sp. strain ABHU2SB）的预测。观测者操作特性曲线 (ROC)（ROC[蓝色曲线]）下的面积显示在中心（95%置信区间(CI)）。

讨论

       对微生物群落的分析揭示了不平衡的膳食锌对肠道菌群的显著影响。低锌膳食并未降低肠道物种丰富度，这与之前在小鼠中的发现一致。有趣的是，缺锌会显著降低肉鸡和仔猪的微生物多样性。结论的差异可能是因为使用的动物模型不同。在畜牧生产中，补充锌可用于给药、提供营养和预防缺陷，并可增加动物的体型和产量。添加锌4周和8周后微生物群落的α多样性下降，与先前在小鼠中的结果一致。此外，氧化锌的药理学摄入量 (2500mgZn/kg) 也被证明可通过降低断奶仔猪空肠和粪便或回肠消化液中的微生物丰度来影响微生物群落。

       膳食锌干预导致门、属和种水平的细菌组成发生了显著变化。变形菌门（Proteobacteria）是生态失调或疾病风险潜在的诊断特征。在4周的喂养期内，低锌和过量锌饮食小鼠的变形菌门（Proteobacteria）和脱硫弧菌属（ Desulfovibrio）显著增加。其中，脱硫弧菌属（Desulfovibrio）是炎症性肠病的潜在生物标志物。在脱硫弧菌属（Desulfovibrio）中发现了锌阻遏物ZUR，它可调节高亲和力锌转运蛋白znuABC。因此，盲肠中缺锌后可能会通过促进锌竞争细菌的定植和生长来调节脱硫弧菌属（Desulfovibrio）的水平。此外，一种重金属抗性基因(tetQ)与变形菌门（Proteobacteria）有关，变形菌门（Proteobacteria）可能具有某些机制来抵消高膳食锌。因此，可以确定变形菌门（Proteobacteria）在锌不平衡条件下具有良好的适应能力。然而，在为期8周的干预中，不同剂量的膳食锌并未显著影响变形菌门（Proteobacteria）的水平。这可能是因为小鼠的肠道菌群会随着年龄的增长逐渐稳定，从而更容易防止潜在病原体的定植。嗜黏蛋白阿克曼菌（Akkermansia muciniphila）是疣微菌门（Verrucomicrobia）的成员，是维持代谢稳态的重要肠道共生体，与低炎症、正常脂质代谢和碳水化合物代谢有关。本研究发现，在4周的干预中，喂食高剂量膳食锌和过量膳食锌的小鼠中，疣微菌门（Verrucomicrobia）的比例增加，而在缺锌的小鼠中比例减少。这与之前的研究一致，表明缺锌会降低疣微菌门（Verrucomicrobia）的相对丰度。在8周的锌干预组别中，发现低锌组中疣微菌门（Verrucomicrobia）丰度较高，而高锌组中丰度较低。这一现象表明，高剂量锌对疣微菌门（Verrucomicrobia）有重要影响，影响是正面还是负面取决于暴露时间。拟杆菌门（Bacteroidetes）与厚壁菌门（Firmicutes ）的比值与多种疾病有关，如人类肥胖、炎症性肠病和2型糖尿病。本研究发现，在短期锌干预中，拟杆菌门（Bacteroidetes）与厚壁菌门（Firmicutes）的比值与锌添加剂量负相关。与先前的研究结果一致，缺锌组拟杆菌门（Bacteroidetes）的丰度显著增加，而厚壁菌门（Firmicutes ）的丰度显著降低。此外，怀孕小鼠在低锌条件下厚壁菌门（Firmicutes ）增加。然而，长期的锌干预对拟杆菌门（Bacteroidetes）与厚壁菌门（Firmicutes ）的比值没有显著影响。8周内喂食不同剂量膳食锌的小鼠体重增加没有显著差异。我们推断，长期和短期锌干预对拟杆菌门（Bacteroidetes）与厚壁菌门（Firmicutes ）比值的影响可能不仅与肠道锌积累持续时间有关，而且与年龄有关，因为Mariat等人证明拟杆菌门（Bacteroidetes）与厚壁菌门（Firmicutes ）的比值在不同的生命阶段具有差异。

       对总SCFAs和单一SCFA的分析显示，不同组别之间存在显著差异。不同动物模型中低锌对SCFAs浓度的影响结论存在矛盾。Reed等人发现雏鸡缺锌组的SCFAs浓度显著降低，而Pieper等人对猪的研究结果恰恰相反。在本研究中，在短期干预期间，低锌组的细菌代谢物水平较高，尤其是乙酸。从属水平上看，短期缺锌小鼠细菌代谢物水平与产乙酸、丙酸和丁酸等代谢物的细菌【如黄杆菌属（Flavonifractor）、另枝菌属（Alistipes）、杆菌属（Odoribacter）、厌氧棍状菌属（Anaerotruncus）、拟杆菌属（Bacteroides）、毛螺旋菌属（Parasutterella）】呈显著正相关。之前研究发现，盲肠SCFAs浓度（特别是乙酸和丁酸浓度）与盲肠pH值相关。盲肠环境的改变，如通过增加SCFAs水平降低pH值，可导致锌的生物利用度和吸收显著增加。我们的数据表明，缺锌小鼠肠道菌群组成的变化可以提高锌利用率。然而，众所周知，高剂量乙酸盐可以穿过血脑屏障到达下丘脑，降低食欲和营养摄入。缺锌小鼠的摄食量受到抑制，表明乙酸增加是摄食量减少的原因之一。此外，过量锌对SCFAs浓度的负面影响与之前对仔猪的研究结果一致。在长期干预中，高锌喂养小鼠的SCFAs浓度（除了戊酸和己酸）最低。

       与SCFAs的结果一致，高锌喂养小鼠的KEGG途径“脂质代谢”也显著降低。此外，SCFAs通过抑制炎症来促进肠上皮的完整性。在8周高锌喂养小鼠中发现部分结肠炎性细胞浸润。我们推测，长期接触高剂量锌会通过减少短链脂肪酸和降低微生物多样性来增加结肠炎易感性。IBD患者的粪便中SCFAs减少且α多样性降低。此外，长期过量锌组小鼠的戊酸浓度急剧下降。戊酸显著降低了艰难梭菌感染（C. difficile infection， CDI）小鼠模型中艰难梭菌（C. difficile）的生长。本研究可进一步支持Zackular等人的研究结论，即过量膳食锌会降低对CDI的抵抗力。

       在人类疾病途径方面，“耐药性”和“感染性疾病”在高锌组中的丰度最高，而在低锌组中的丰度最低。150 mg/kg锌有助于富集具有耐药基因的潜在病原体。为了进一步讨论肠道锌对人类疾病的影响，我们评估了前20种益生菌和潜在病原体的差异。

       罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）是一种经过充分研究的益生菌。研究发现，罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）丰度下降与同期炎症性疾病发病率增加有关。在我们的研究中，罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）受到不平衡锌饮食的显著影响。在4周和8周的干预中，过量锌组的罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）比例最低。也有报道称，罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）在猪体内受药理剂量氧化锌（2425 mg/kg）的影响较小。肝螺杆菌（Helicobacter hepaticus）是肠道或肠肝螺杆菌。肝螺杆菌（Helicobacter hepaticus）的增殖与慢性肝炎、IBD、结肠炎和胆结石有关。在短期低锌组和长期高锌组中肝螺杆菌（Helicobacter hepaticus）丰度较高。关于膳食锌水平与肝螺杆菌（Helicobacter hepaticus）丰度之间的关系知之甚少。先前的一项研究表明，幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）感染对儿童的血清锌水平没有显著影响。然而，Tran等人发现短期补锌（醋酸锌，1 mg/ml；ZnSO4，5 mg/ml）可缓解猫螺杆菌（Helicobacter felis）引起的小鼠胃炎。因此，幽门螺杆菌（Helicobacter species）与锌水平之间的相关性需要进一步研究。

       以前的研究倾向于利用血清锌、指甲锌和锌相关基因/蛋白质（酶、炎症细胞因子、转运蛋白和结合蛋白）来反映膳食锌摄入量。本研究发现，黑色素杆菌(Melainabacteria)（门）和脱硫弧菌属ABHU2SB菌株（Desulfovibrio sp. strain ABHU2SB）（种）的相对丰度似乎能有效鉴定小鼠体内锌水平是缺乏、正常或高/过量。锌相关基因/蛋白质表达的生物标志物不够敏感，无法揭示相对短期锌干预中锌状态的差异，且无法区分锌缺乏和锌过量。虽然血清锌是目前最可靠的预测指标，但其测量和解释的固有问题可能会破坏血清锌的敏感性和特异性。测序技术和建模算法的发展促进了通过菌群预测营养不良和疾病风险技术的发展，这是微生物组研究的目标之一。具体而言，肠道菌群直接暴露于膳食锌，并且容易受到锌摄入量的影响。Spenser等人发现吲哚梭菌（Clostridium indolis）和未分类的拟杆菌目（unclassified Bacteroidales ）与鸡的最终体重和锌摄入充足率呈负相关，这为慢性缺锌表型的潜在效应提供了证据。然而，梭菌属（梭菌属ASF502、柔嫩梭菌Clostridium leptum等）的相对丰度与小鼠4周和8周时间间隔内的喂食锌的关系不大。我们的结果表明，在短期和长期干预中，黑色素杆菌(Melainabacteria)（门）和脱硫弧菌属ABHU2SB菌株（Desulfovibrio sp. strain ABHU2SB）（种）ABHU2SB（物种）与血清锌水平显著相关，并与锌摄入剂量有关。黑色素杆菌 (Melainabacteria) 是一种能合成维生素B和K的有益微生物，常存在于地下水、废水处理厂、食草动物和人类内脏中，于2013年被鉴定发现。ROC分析表明，黑色素杆菌 (Melainabacteria) 区分低锌水平和高/过量锌水平的AUC均高于0.85。最近的一项研究报告称，黑色素杆菌(Melainabacteria)在淡水中的丰度排名第二（未检测到锌），但在不流动水样中的丰度排名下降（检测到锌），这与我们对小鼠的研究结果一致。脱硫弧菌属ABHU2SB菌株（Desulfovibrio sp. strain ABHU2SB）对锌缺乏状态的预测精度高于0.85，对锌过量状态的预测精度高于0.8。脱硫弧菌属ABHU2SB菌株（Desulfovibrio sp. strain ABHU2SB）的功能以及锌对脱硫弧菌属ABHU2SB菌株（Desulfovibrio sp. strain ABHU2SB）的影响尚未得到很好的研究。脱硫弧菌属ABHU2SB菌株（Desulfovibrio sp. strain ABHU2SB）在实验性自身免疫性葡萄膜炎大鼠和2型糖尿病动物模型KKAy小鼠中生长旺盛。未来需要进一步研究不同剂量膳食锌对这些潜在微生物标志物调节的机制，以阐明这种特定微生物在锌失衡的病因和/或进展中的作用。

       总的来说，本研究发现膳食锌是微生物群落结构的重要介质，锌缺乏和锌过量都会导致肠道菌群失调。此外，本研究还发现了可鉴定锌状态的特定微生物生物标志物，并将其与血清锌水平进行关联。我们的研究发现，短期低锌饮食（0 mg/kg）和长期高锌饮食（150 mg/kg）对小鼠模型有明显的负面影响。这些结果表明在补充锌时应注意剂量和持续时间。