慢性自发性荨麻疹患者肠道菌群及代谢异常

1 受试者的一般特征

在本研究中，我们招募了79名受试者，包括39名CSU患者和40名HCs患者。两组在年龄、性别比、体重指数(BMI)等方面均无显著性差异(p >0.05)。表1提供了研究对象的基本特征，包括CSU患者的一系列临床特征。

表1 参与者的人口统计学和临床特征。

CSU, 慢性自发性荨麻疹; HCs, 健康对照组; BMI, 身体质量指数; IQR, 四分位范围

2 基于16S rRNA基因测序数据的CSU患者和HC肠道微生物组研究

2.1 HCs和CSU患者的肠道微生物组多样性的比较

从79名受试者(39名CSU患者和40名HCS患者)的粪便样本中共获得519,595条高质量序列(每个样本6,577条序列)。为了评估CSU患者和HCs患者肠道微生物多样性的变化，我们使用了6个指数，即Chao1、均匀度、Faith’s PD、OTUs以及Shannon和Simpson指数(图1A和附表1)来检测α-多样性。两组间肠道菌群α-多样性差异不显著(p >0.05)。对于β-多样性(图1B和附表2)，我们观察到CSU患者和HCS患者之间的Jaccard距离有显著差异(*p <0.05)。

图1 比较慢性自发性荨麻疹(CSU)患者与健康对照组的肠道菌群多样性。(A) CSU患者和HCs的α-多样性采用Chao 1指数、均匀度、Faith’s系统发育多样性(PD)、观察操作分类单位(OTUs)、Shannon指数和Simpson指数进行测量。两组间α-多样性无差异(p<0.05)。(B) CSU患者与HC B多样性(Jaccard distance index)的组间差异。使用PerMANOVA进行统计分析(*p <0.05）， n，无显著差异。

2.2 CSU患者和健康对照人群的肠道菌群的丰度

在不同的分类水平上，研究了两组间的细菌群落和相对丰度。在门水平上，CSU患者肠道菌群与HCs相似，包括:Firmicutes（厚壁菌门）、Bacteroidetes（拟杆菌门）、Proteobacteria（变形菌门）和Actinobacteria（放线菌门）(图2A和附表3)。CSU患者中厚壁菌门的相对丰度增加，变形菌门的相对丰度降低。在属水平上，与HCs相比，Faecalibacterium（粪杆菌属）、Roseburia（罗氏菌属）、Lachnospira（毛裸菌属）、Gemmiger、Prevotella（普雷沃氏菌属）和Bifidobacterium（双歧杆菌属）的相对丰度在CSU患者中增加，而Blautia （布劳特氏菌属）、Ruminococcus（瘤胃球菌属）、Oscillospira（颤螺菌属）、Megamonas（巨单胞菌属）、Dialister（小杆菌属）、Bacteroides（拟杆菌属）、Parabacteroides、Alistipes（理研菌属）、Sutterella（萨特氏菌）在CSU患者中减少（图2B和附表4）。

为了研究更有可能解释CSU患者与HCs差异的特征，我们进行了LefSe分析（附表5）。log₁₀LDA分数以条形图表示。在科水平上，通过LEfSe分析，CSU患者粪便中Lactobacillaceae（乳酸杆菌科）、Turicibacteraceae（苏黎世杆菌科）和Peptostreptococcaceae（消化链球菌科）明显多于HCs,Veillonellaceae（韦荣氏球菌）明显少于HCs (图2C)。在属水平上，与HCs相比，CSU患者中Lachnobacterium、Turicibacter、Lactobacillus显著富集，Phascolarctobacterium显著减少 (图2D)。综上所述，CSU患者的肠道微生物群落结构存在偏好性。

鉴于CSU患者的肠道菌群与HCs的不同，了解肠道微生物区系是否可以作为CSU诊断和预测的潜在生物标志物将是一件很有意义的事情。为此，我们采用上述候选科属的相对丰度作为CSU的预测因子。用ROC曲线分析比较CSU患者和HCs肠道菌群时的AUC值，发现CSU患者肠道微生物群的特点是Lactobacillaceae，Turicibacteraceae， Peptostreptococcaceae， Lachnobacterium， Turicibacter和Lactobacillus的相对丰度增加，而Veillonellaceae 和 Phascolarctobacterium的相对丰度降低，这是CSU患者肠道微生物群的主要特征。他们的ROC值分别为0.411[95%CI=0.285~0.537]、0.422(95%CI=0.295~0.549)、0.376(95%CI=0.251~0.5)、0.448(95%CI=0.321~0.576)、0.437(95%CI=0.31~0.564)、0.424(95%CI=0.298~0.551)、0.663(95%CI=0.539~0.788)和0.616(95%CI=0.49~0.741)。然后，我们尝试将这些细菌结合起来，获得更好的监测价值，以便区分CSU患者和HCs。Lactobacillaceae, Turicibacteraceae， Peptostreptococcaceae， Lachnobacterium， Turicibacter，Lactobacillus，Veillonellaceae 和Phascolarctobacterium的联合作用AUC值为0.738(95%CI=0.629-0.847)(图2E)。这些结果提示，肠道菌群紊乱有可能区分CSU患者和HCs。

利用39例CSU患者的临床资料，进一步分析了这8个科或属的肠道微生物相对丰度与体重指数(BMI)、CSU确诊时间、血管性水肿并发症、食物过敏史、药物过敏史、荨麻疹家族史等临床特征的潜在相关性。然而，这8种肠道微生物中的任何一种的丰度与6种临床特征中的任何一种都没有确定相关性。

我们还进行了一项分析，根据肠道微生物多样性的不同模式将CSU患者分为A组和B组（附图1A,B）。当我们比较A组和B组患者的临床差异时，两组患者在体重指数(BMI)、CSU确诊时间、血管水肿并发症、食物过敏史、药物过敏史或荨麻疹家族史方面均无显著差异（附图1C-H）。

图2. 慢性自发性荨麻疹(CSU)患者与健康对照组的粪便细菌群落丰度。(A, B)两个类群在门(A)和属(B)水平上的相对丰度。只显示了前10个门和前20个属。(C, D)线性判别分析(LDA)表明，与HCs相比，CSU患者的肠道细菌种类丰富。(LDA得分比>2, p<0.05）。CSU患者(蓝色)和HCs (黄色)粪便样本中富集的细菌类群由科(C)和属(D)水平的LDA评分显示。(E) 选定科属组合识别CSU患者和HCs的受试者工作特征(ROC)曲线。ROC曲线下面积(AUC)显示的是具有95% CI的微生物组合预测因子。

为了评估CSU患者与HCs的肠道微生物群落的功能差异，我们使用PICRUSt计算它们的丰度，使用KEGG将它们分配到代谢途径，然后测试两组之间的差异。与HCs相比，在检测的328条代谢途径中，CSU组仅G蛋白偶联受体(GPCR)途径与肠道微生物组相关（图3A和附表6）。

接下来，我们考察了以上提到的CSU的预测因子Lactobacillaceae，Turicibacteraceae， Peptostreptococcaceae， Lachnobacterium， Turicibacter，Lactobacillus，Veillonellaceae 和 Phascolarctobacterium等细菌是否与GPCRs有关，以深入了解特定的菌群如何在CSU的异常代谢途径中起作用。有趣的是，在CSU组，Lactobacillaceae、Turicibacter和Phascolarctobacter与GPCRs呈正相关(图3B)。这表明CSU患者肠道菌群的改变可能通过对GPCRs的影响而促进CSU的进展。

图3 慢性自发性荨麻疹(CSU)患者与健康对照组(HCs)之间预测的代谢通路不同。(A) Mann Whitney检验显示CSU患者与hc患者预测的代谢途径存在显著差异(*p <0.05）。(B) Lactobacillus、Turicibacter和Phascolarctobacterium的丰度与G蛋白偶联受体的关联。(Spearman’s等级相关系数、r值和p值显示)。

3 CSU患者与HCs肠道代谢组学分析的差异

3.1 肠道代谢组学概况

代谢组是指参与机体代谢，维持机体正常生长发育的小分子化合物的集合。这些主要是指相对分子质量小于1000的内源性小分子。我们对从24份粪便样本中提取的代谢物进行了代谢组学分析(其中12份来自39例CSU患者，12份来自40例HC)。共获得6377个分子特征，使用MetaAnalyst 3.0进行统计分析。PLS-DA显示CSU患者和HCs表现出明显的聚类，Q²为0.24，R²Y为0.88，表明该模型没有过度提升，是可靠的(图4A)。VIP评分为1.0在多变量统计分析及p<0.05在单变量分析中的被认为是显著差异代谢物，并通过热图显示(图4B)。与HCs相比，CSU患者的粪便中有5种显著差异的二级代谢产物发生改变（附表7）。其中，在CSU患者中，α-MG和甘草酸表达上调，3-吲哚丙酸(IPA)、黄嘌呤和异丁烯酸表达下调。

然后我们分析了这五种代谢物在粪便样本中的丰度与临床特征的相关性，如BMI、诊断CSU后的时间、血管性水肿的并发症。食物过敏史、药物过敏史、以及慢性荨麻疹家族史。使用这12名CSU患者的数据对慢性荨麻疹进行研究。有趣的是，粪便中黄嘌呤的丰富程度与诊断后的时间呈负相关(Spearman’s的相关分析：r = -0.662， p = 0.0227)（附图2A）。与诊断为CSU后不到12个月的8名患者相比，诊断为CSU后至少12个月的4名患者粪便中黄嘌呤的丰度明显较低（非配对t检验：p = 0.0028）(附图2B)。同时，与 9名没有血管性水肿病史的患者相比，3名有复杂的血管性水肿患者，其粪便中的IPA含量明显较高。(非配对t检验：p = 0.0321) (附图2C)。

图4 慢性自发性荨麻疹(CSU)患者与健康对照组(HCs)的代谢特征识别。(A) CSU患者和HCs粪便代谢组学的偏最小二乘判别分析(PLS-DA)。红色和绿色标记分别代表CSU患者和HCs。(B) CSU患者和HCs的粪便代谢模式以热图显示。行表示代谢物的数据，列表示样本。红色和蓝色分别代表CSU患者与HCs的代谢物水平的升高和降低。(C) 粪便代谢产物与微生物属的相关性显著变化。红色星号方框表示|r| > 0.60, p < 0.05。蓝色表示正相关，白色表示负相关。

3.2 比较CSU患者和HCs的代谢物功能差异

利用KEGG途径预测代谢途径中显著差异的代谢物。结果表明，与HCs相比，CSU患者在咖啡因代谢、蛋白质消化吸收、嘌呤代谢等一些代谢途径发生了显著变化(附表8)。黄嘌呤的减少与咖啡因代谢和嘌呤代谢有关。异丁酸的减少与蛋白质的消化吸收有关。

对粪便代谢组学分析中筛选出的发生改变的代谢物和16S rRNA基因测序分析筛选出的肠道菌群紊乱的属进行Spearman’s相关性分析。相关系数|r| > 0.60，p < 0.05具有统计学意义。Lachnobacterium与α-MG呈显著正相关(附表9)。相关性热图显示了紊乱的肠道菌群属与改变的粪便代谢物之间的共变异，如图4C所示。

在我们的研究中，使用16S rRNA基因测序和代谢组学分析对CSU患者的肠道微生物组和代谢物进行了分析。我们的发现主要揭示了在CSU组中Lactobacillus, Turicibacter 和Lachnobacterium显著增加，而Phascolarctobacterium则减少。紊乱的肠道细菌可能通过GPCRs影响 CSU的进展，说明CSU可能与肠道细菌的紊乱有关。

从β-多样性结果来看，CSU患者与HCs的类群不同，说明CSU患者的个体微生物群落差异更大，这与最近两项关于CSU的研究结果一致。我们的研究与最近样本量更大的研究在结果之间的有一个微小差异，与HCs相比，我们没有检测到细菌的α-多样性有显著差异，这可能事由于样本量、地理背景、饮食习惯、以及两项研究中受试者的年龄的差异引起。尽管如此，研究人员发现微生物多样性措施在食物过敏或食物过敏患者和HCs之间没有差异。因此，微生物多样性在过敏或CSU中的作用仍是争论的焦点，需要进一步调查。这也表明，在影响这些疾病的发展方面，特定的微生物可能比多样性更重要。

在本研究中所有测试对象身上都检测，厚壁菌门，拟杆菌门，变形菌纲和放线菌纲最为丰富。这些结果与之前的研究一致。在属水平上，通过对我们的数据进行LEfSe分析，我们发现与HCs相比，CSU患者中Lactobacillus、Turicibacter和Lachnobacterium显著富集。我们的数据还显示，根据AUC分析，包括这3 个细菌在内的8个科或属的丰度具有区分CSU和HCs的潜力。

Lactobacillus spp.是革兰氏阳性兼性厌氧杆状细菌，能够将葡萄糖和其它糖类发酵成乳酸或发酵成乳酸，二氧化碳和乙醇。乳酸菌能够维持一个酸性环境去限制其他微生物的生长和维持人类生态系统中的生理和微生物的平衡。乳酸菌作为一种益生菌在预防和治疗过敏性疾病方面的作用已被报道。一些研究报道，有湿疹或过敏性疾病家族史的婴儿的乳酸杆菌科(乳杆菌属)丰度较低。然而，临床试验和观察性研究的结果并不一致。乳酸菌对降低湿疹、哮喘或牛过敏的风险是无效的。我们的研究结果与之前一项基于qPCR的研究结果一致，该研究发现，CSU患者的乳酸菌相对数量减少。有趣的是，食物致敏的儿童的乳酸菌和乳酸杆菌数量显著增加。因此，需要进一步探讨乳酸菌种类在肠道中的丰度及其在CSU和过敏发病机制中的作用。

Turicibacter是革兰氏阳性、厌氧、不形成孢子的细菌。胃肠道的Turicibacter依赖宿主免疫细胞和细菌传感器生存。研究表明, 与野生型小鼠相比，两种免疫缺陷小鼠模型(先天免疫缺陷和B细胞和T细胞缺陷)和toll样受体2基因敲除小鼠胃肠道内的Turicibacter已经完全消失,表明这些细菌和宿主免疫调节之间的相互作用。2019年，Fung等人发现血液Turicibacter sanguinis表达了一种与5-羟色胺序列和结构同源的神经递质钠转运体相关蛋白，它在一定程度上导致了过敏条件下的急性症状，如过敏原诱发的哮喘、荨麻疹和过敏反应。因此，Turicibacter和CSU之间的生物相互作用，尚未报到，值得进一步研究。

Lachnobacterium spp.是Lachnospiraceae家族的一员，是革兰氏阳性，专性厌氧，长直杆状细菌，可以将葡萄糖发酵成乳酸以及极少量的乙酸和丁酸。Shen等人发现，在老年人(≥60岁)中，年龄与Lachnobacterium的存在呈负相关，且在被试者中，与衰老相关的Lachnobacterium的减少可能会对他们的健康产生负面影响。另一项研究指出，在发生特异性皮炎和哮喘的儿童中，Lachnobacterium显著减少。我们的研究结果表明，Lachnobacterium在CSU组中大量存在，但其生物学意义有待进一步探索。根据相关性分析，Lachnobacterium与α-MG呈相关性，且在CSU组中含量丰富。α-MG是口山酮的主要衍生物之一，具有多种作用，包括抗炎、抗微生物、抗疟疾、抗癌、抗肥胖和细胞毒性作用。它还能控制自由基氧化，维持心血管和肠胃系统的健康。但其对过敏性疾病的作用尚不明确。

我们的相关性分析表明，Lactobacillus，Turicibacter和Phascolarctobacterium可能与CSU的发病机制有关。GPCRs是最大的七种跨膜结构域受体家族，调节生命细胞功能，如细胞增殖，发育，生存，代谢和神经元信号传输。家族成员包括：GPR43、GPR41、GPR109A、GPR120、GPR40、GPR84、GPR35, GPR91和GPR65。通过GPCRs的信号传导通常具有抗炎作用，而一个或多个GPCRs信号传导缺乏可能导致人类疾病，如哮喘、食物过敏和炎症性肠病。越来越多的证据表明GPCRs直接参与肥大细胞(MC)的脱颗粒和释放。MCs上表达的各种GPCRs可能在人类过敏反应性疾病中发挥重要作用。研究人员发现，人类MCs在Mas相关GPCR X2 (MRGPRX2)的介导下，对抗菌宿主防御肽、神经肽、主要基础蛋白和嗜酸性粒细胞过氧化物酶做出反应而被激活并分泌组胺。屋尘螨主要的过敏原Der p1激活Mas相关的GPCR X1 (MRGPRX1)，可能导致过敏和炎症的发生。GPR43在哮喘的小鼠卵白质模型中起作用。短链脂肪酸（SCFA）受体（GPR41、GPR43和GPR109A）和GPR84与食物过敏有关。前列腺素（PGs）通过GPCRs影响过敏性炎症。因此，在MCs上表达的GPCRs可能成为治疗过敏性疾病的潜在药物靶点。研究人员发现，嗜酸乳杆菌通过上调SCFAs及其受体GPR41/43来保护过敏性炎症的发生。GPCRs与Turicibacter或Phascolarctobacterium之间的联系，以及它们如何参与CSU的发病机制，尚未有报道。

代谢组学能够以系统生物学方法对代谢物进行大规模、定性和定量的研究。在这项研究中，肠道代谢分析显示异丁酸，IPA，黄嘌呤在CSU患者中减少。异丁酸是短链脂肪酸之一，可以刺激调节性T细胞（Tregs）的增殖，这种T细胞亚群在抑制过敏性和自身免疫性疾病的发展中发挥着重要作用。此外，外周Tregs的数量在CSU患者中明显下降。因此，我们的数据证实了以前的知识。IPA是一种饮食中的色氨酸代谢物，完全由共生肠道细菌产生，并从肠道吸收到血流和脑脊液中。IPA发挥抗炎和抗氧化作用，其对血管性水肿的致病作用尚不清楚。黄嘌呤，是在三磷酸腺苷(ATP)降解过程中产生的嘌呤衍生物。抑制炎症是黄嘌呤的一个重要药理作用。CSU患者存在一种炎症状态，这可能与抗炎成分的减少有关，包括但不限于IPA和黄嘌呤。Yu等人发现嘌呤循环代谢活动的改变也与过敏性哮喘有关。此外，脑脊液中较低水平的黄嘌呤与抑郁症相关，这可能部分解释了CSU患者中抑郁症的高患病率。我们的数据还显示了黄嘌呤与CSU诊断以来的时间之间的有趣相关性，尽管这需要在更大的样本量中进一步验证。

总之，我们通过高通量分子技术揭示了紊乱的肠道微生物组成和代谢产物，这为研究CSU的发病机制提供了潜在的线索。我们的工作为进一步研究肠道细菌与代谢产物和免疫之间的分子相互作用建立了一个重要的知识框架，这将增强我们对CSU发展机制的理解。这一进展也可能为这种复杂疾病的干预提供新的潜在目标。然而，本研究的一个不足之处是，在本研究的设计过程中没有考虑到年龄、饮食等潜在的混杂因素。由于方法的局限性，真菌定植也没有被评估。此外，由于缺乏详细讨论的相关资料，未对从甘草植物的根中提取的化学物质-差异代谢物甘草酸进行讨论。作为一项样本量有限的研究，我们的研究结果的概括性应谨慎评价。因此，在未来的研究中，有必要进行样本量更大、纳入更多关键因素的多中心研究。

原名：Abnormalities in Gut Microbiota and Metabolism in Patients With Chronic Spontaneous Urticaria

译名：慢性自发性荨麻疹患者肠道菌群及代谢异常

期刊：Frontiers in immunology

IF：7.561

发表时间：2021.10.15

通讯作者：龙海

通讯作者单位：中南大学湘雅二医院

DOI号：10.3389/fimmu.2021.691304