万岁桂教授：一文梳理B-NHL肿瘤分型和流式分析特点

淋巴瘤的诊断难度较大，往往需要综合血液病理学（包括组织和细胞形态学、免疫表型、遗传学和分子生物学）与临床特征才能做出精确诊断，但流式细胞术（FCM）免疫分型作为与免疫组织化学相补的诊断方法，以其快速、客观、定量及多参数分析等独特优势，在淋巴瘤诊断方面也发挥着不可替代的作用。

为了帮助大家更好地了解流式检测技术在成熟B细胞非霍奇金淋巴瘤（B-NHL）肿瘤诊疗中的应用，高博流式创新研究院系列课程再次邀请首都医科大学宣武医院万岁桂教授，为我们分享《B-NHL WHO分型和流式分析》的精彩内容。

B-NHL WHO分型简介

2016年，世界卫生组织（WHO）发布了2008 WHO造血和淋巴肿瘤分类第4版分型的更新版本，主要修饰了部分淋巴瘤的诊断标准，深化了遗传学以及分子生物学在多种淋巴瘤诊治中的意义，加入了少数临时的淋巴瘤类型。在这版更新中，有以下内容需要我们关注：

1

慢性淋巴细胞白血病（CLL）更新

外周血B淋巴细胞（CD19+细胞）计数≥5×109/L；B淋巴细胞<5×109/L且缺乏髓外病变时，即使存在血细胞减少或疾病症状，也不能诊断CLL。

2

单克隆B淋巴细胞增多症（MBL）更新

2016WHO MBL分成“低计数”和“高计数”两类。低计数组是外周血淋巴细胞<0.5×109/L，临床上极少进展，一般不需要常规随访；高计数组外周血淋巴细胞≥0.5×109/L，其生物学行为与CLL Rai 0期类似，必须每年常规随访1次。

3

套细胞淋巴瘤（MCL）更新

（1）新增原位套细胞肿瘤：CCND1+，临床很少进展；

（2）经典MCL（多见）：CCND1+，无或少 IGHV突变、SOX11+侵袭性淋巴瘤，发生TP53等突变转变成母细胞MCL和多形 MCL；

（3）白血病性MCL（少见）：IGHV突变+，SOX11-B细胞发展而来，表现为惰性白血病的非结内MCL，累及PB、BM和脾，发生TP53等突变发生快速进展。

4

滤泡淋巴瘤（FL）更新

（1）儿童型滤泡淋巴瘤（原名称：儿童滤泡淋巴瘤）：主要发生于儿童及年轻人，极少发生于老年人，为一种预后较好的局部增生性疾病，具有低度恶性潜能；

（2）原位滤泡瘤变（原名称：原位滤泡淋巴瘤）：反映其进展为淋巴瘤的风险低，需与FL部分累及淋巴结鉴别，染色体数量异常少于FL。正常个体循环中可存在 t(14;18)(q32;q21)IGH/BCL2易位细胞，高水平 t(14;18) 淋巴细胞（＞10-4）预示发生FL 风险更高；

（3）新增伴IRF4重排大B细胞淋巴瘤：伴IRF4重排或IRF4/MUM1高表达，肿瘤呈弥漫生长时与3B级FL或弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）相似；

（4）新增伴1q36缺失弥漫FL包括一些无BCL-2重排的弥漫性FL；

（5）12 指肠型滤泡淋巴瘤： 更新认为消化道 FL 是一种变体。

5

毛细胞白血病（HCL）更新

将BRAF V600E突变加入诊断标准，2016更新版本中100% HCL存在BRAF V600E突变，该突变不存在于HCL-v和其他小B细胞淋巴瘤。

6

HCL-v更新

HCL-v为BRAF V600E突变阴性，50%MAP2K1突变阳性。

7

淋巴浆细胞淋巴瘤（LPL/WM）更新

（1）90%LPL存在MYD88 L265P突变，修订了LPL诊断标准；

（2）IgM MGUS与LPL和其他淋巴瘤相关，而不是MM。

8

Burkitt 淋巴瘤更新

（1）Burkitt淋巴瘤：70%免疫缺陷相关BL、40%流行性BL和30%BL存在TCF3 or ID3突变；

（2）新增Burkitt样淋巴瘤伴11q畸变：MYC-，11q+，复杂核型。

9

DLBCL更新

（1）DLBCL, NOS可以分为GCB和Non-GCB，主要依靠基因表达谱（GFP）细胞来源、免疫组化（CD10/BCL-6/IRF4/MUM1）以及石蜡组织RNA扩增技术进行区分；

（2）高级别B细胞淋巴瘤（HGBCL）：将DHL/THL DLBCL归入HGBL（MYC+ and BCL2+ and/or BCL6+，但满足FL和淋巴母细胞淋巴瘤标准则不纳入）；

（3）提出双表达淋巴瘤（double-expressor lymphoma）：重排-蛋白表达+ (MYC>40%，BCL-2>50%)，预后比其他DLBCL, NOS差，但优于DHL/THL DLBCL；

（4）HGBCL, NOS：取代了2008版中DLBCL/BL，包括DHL/THL（不管形态像DLBCL还是BL）、形态介于DLBCL与BL之间类型；

（5）CD30+ DLBCL, NOS：阳性率大约为10-25%，是重要的治疗靶点，适合用流式进行检测；

（6）EBV+ DLBCL, NOS：代替EBV+ DLBCL of the elderly。

B-NHL NCCN分型简介

根据细胞大小分为以下三大类：

1

Small cell-免疫表型特征

主要是靠CD5, CD10, CD23, CD25, CD103, cyclin D来层级分类（图1）。

图1 Small cell分类流程图

2

Medium cell-免疫表型特征

基本同上，增加了增殖指标Ki67（图2）。

图2 Medium cell分类流程图

3

Large cell-免疫表型特征

主要靠CD5, CD10, CD103, IRF4/MUM1来分类（图3）。

图3 Large cell分类流程图

正常B淋巴细胞免疫表型

正常外周血和淋巴组织中B细胞的分布情况如图4~图5及表1所示，一般而言，淋巴组织中B细胞的比例大于外周血中的。

图4 正常外周血和淋巴组织内B细胞流式示意图

图5 正常外周血和淋巴组织内B细胞流式示意图

（图中可见正常组织中B细胞都是多克隆）

表1 外周血和淋巴结淋巴细胞分布情况

异常B细胞免疫表型

异常B细胞免疫表型主要包括抗原表达异常、免疫球蛋白轻链限制性表达和散射光异常。

1

抗原表达异常

抗原表达异常有以下几方面，最重要的是CD5和CD10。

• CD19/CD20/CD22/CD79b/CD43表达增强、减弱；

• CD5+；

• CD10+；

• CD45增强或减弱；

• CD10/BCL-2同步表达。

2

免疫球蛋白轻链限制性表达

• 只表达一种轻链（kappa或lamda链）；

• Kappa/lamda均不表达（双阴性）；

• Kappa/lamda比值异常（>3:1或<0.3:1）；

• 注意：限制性表达不等于肿瘤性。

3

散射光异常（FSC、SSC改变）（图6）

图6 散射光异常细胞流式示意图

（左图为小细胞，为多克隆，右图为异常的大细胞，其为单克隆）

FCM B-NHL免疫表型分析示例

图7 成熟B细胞淋巴瘤的典型免疫表型鉴别诊断流程图

首先根据成熟B细胞淋巴瘤的典型免疫表型鉴别诊断流程图（图7），我们可以直观了解不同B细胞淋巴瘤免疫表型的特点。根据这些特点具体介绍如下：

1

慢性淋巴细胞白血病（CLL）

• 形态学：成熟的小淋巴细胞显著增多，可见幼稚淋巴细胞和涂抹细胞，不典型CLL幼稚淋巴细胞可>10% ，但≤55%；

• 典型的免疫表型：CD19+、CD5+、CD10-、CD23+、FMC7-、CCND1-；sIg、CD20、CD22及CD79b弱表达；

• 流式细胞学确认B细胞限制性表达κ或λ轻链（κ∶λ>3∶1或<0.3∶1）或>25%的B细胞sIg不表达。

2

套细胞淋巴瘤（MCL）

• 形态：成熟小淋巴细胞为主；

• 免疫表型：CD19+、CD5+ 、CD10-、CD23- 、FMC7+，sIg、CD20及CD79b强表达；

• CCND1+；

• 特征性遗传学异常：t(11,14)(q13 q32)。

CLL与MCL免疫表型特点的不同可见图8。

图8 CLL与MCL的免疫表型区别

有一些不典型的CLL或者变异性的CLL和MCL难以鉴别，可以用CLL/SLL积分系统进行判断（图9）：

图9 CLL/SLL积分系统

对于2-3分的难鉴别者则可以用CD200和CD43进行鉴别（图10）：

图10 CD200和CD43流式示意图

（图中天蓝色的为CLL MS 2-3分的CLL，其高表达CD200和CD43；红色的为MCL，低表达CD200和CD43）

此外还有其他用来鉴别的免疫表型，例如CD148和CD81都是在CLL中弱表达或者不表达，而MCL有特异的CCND1分子遗传学改变。

3  

滤泡淋巴瘤（FL）

• 主要依靠病理形态学诊断；

• FCM免疫表型对诊断帮助有限；

• 40%-70%骨髓侵犯，FCM可以评估骨髓侵犯情况；

• 可进展为DLBCL。

具体的免疫表型特点如下：

• FSC小；

• CD19+CD5-CD10+；

• CD19/CD20/CD22弱表达；

• Bcl-2+BCL-6+；

• t(14,18)(q32,q21)；

• CD5+<3%，此时需做t(11,14),t(14,18)鉴别。

4

毛细胞白血病（HCL）

• 形态：外周血和骨髓中毛细胞；

• 免疫表型：CD19+CD5-CD10-，sIg+，CD11c+ CD103+CD25+，CD123+，CD200+；

• 遗传学：BRAF V600E突变。

5

B细胞幼淋巴细胞白血病（B-PLL）

• 外周血幼稚淋巴细胞占淋巴细胞比例>55%；

• 免疫表型：CD19+、CD5-/+、CD10-、CD23-、FMC7+、CCND1-；sIg、CD20及CD79b强表达；

• 鉴别诊断：CLL伴Richter转化、CLL伴幼淋巴增多、MCL母细胞变异型；

• CLL/SLL积分<2；

• CCND1-。

6

淋巴浆细胞淋巴瘤/华氏巨球蛋白血症（LPL/WM）

• 形态：小淋巴细胞，浆细胞样淋巴细胞，浆细胞；

• 血清IgM升高；

• 免疫表型：CD19+、CD5-、CD10-、CD23-、FMC7+、CCND1-；sIg、CD20及CD79b强表达；

• 90% MYD88/L265P突变。

LPL和边缘区淋巴瘤（MZL）都是CD5-CD10-CD103-，可以通过以下特点进行鉴别：

LPL：

• 外周血淋巴细胞增生少见；

• 常伴IgM；

• 形态：小淋巴细胞，浆细胞样淋巴细胞，浆细胞；

• 骨髓浆细胞明显；

• CD5-CD10-；

• CD200+CD1a-；

• MYD88+ 90%；

• <10%病例CD5+or CD10+；

• 30%病例CD23+；

• 部分病例CD13+（>1%）。

MZL：

• 外周血淋巴细胞增生多见；

• 少伴IgM；

• 形态：小淋巴细胞，伴绒毛；

• 骨髓浆细胞不明显；

• CD5-CD10-；

• CD200-/dim+CD1a+；

• MYD88+ 10%-20%；

• 20%-25%病例CD5+；

• 部分病例CD200dim+,可与MCL鉴别。

7

脾弥漫性红髓小B细胞淋巴瘤(SDRPL)

• CD19+CD5-CD10-；

• CD20,CD22强表达；

• CD11c+；

• 30%CD5+ or CD23+,但很少同时表达。

先前提到的CD180/CD200也可用于鉴别SDRPL和其他小B细胞淋巴瘤类型（图11）。

图11 CD200/CD180在SDRPL/SMZL/HCL中的表达水平差异

（图A是CD200的水平，图B是CD180的水平，右图是CD200和CD180的比值。这些指标在不同肿瘤之间都有明显的特异性，因此可用于鉴别诊断）

8

MCL/多形MCL

• FSC中-大；

• CD19+CD5+CD10-CCND1+；

• CCND1-/CCND2+（多数为CCND1阳性，但要注意有小部分是CCND1阴性CCND2阳性）。

9

CLL伴幼稚淋巴转化

• FSC中-大；

• 形态：幼稚淋巴细胞增多；

• CD19+CD5+CD10-；

• CLL免疫表型；

• CCND1-。

10

CLL Richter转化

• 淋巴结>5cm；

• 淋巴结增长迅速（倍增时间<3个月）；

• 出现可疑结外病变；

• B症状；

• LDH显著升高；

• 病理证实为侵袭性淋巴瘤（MBCL,HL）。

11

伯基特淋巴瘤（BL）

• FSC中-大，形态原始，有空泡（L3）；

• CD19+CD5-CD10+；

• CD38++；

• Bcl-2+/-,Bcl-6+；

• Ki67>95%；

• IG-MYC rearrangement+；

• 多数存在t(8;14)(q24;q32)。

12

DLBCL

• 最常见NHL；

• 可由FL/MCL/CLL Richter转化而来；

• 5%-10% CD5+；

• 30%-50% CD10+；

• 10%-15% CD30+。

13

浆母细胞淋巴瘤

• 形态：免疫母细胞、浆母细胞；

• CD38, CD138, MUM1, VS38c +；

• CD20-,PAX5-,CD56-,CD79a表达水平不一；

• 100%EVB+；

• HIV+比例高；

• 50%t(8,14)；

• C-myc,TP53高表达。

14

ALK阳性大B细胞淋巴瘤

• 形态：免疫母细胞、浆母细胞；

• CD138，BLIMP1 and XBP1+；

• ALK+；

• STAT3高表达；

• MYC蛋白+，MYC重排-。

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原发性渗出性淋巴瘤

• 侵犯胸腹腔、心包，恶性胸腹水，心包积液；

• 形态：免疫母细胞、浆母细胞；

• CD20-CD138+CD56-LANA+；

• HIV+,EBV+,HHV8+多见。

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原发中枢神经系统的弥漫大B细胞淋巴瘤

• 无淋巴瘤病史；

• 原发中枢神经系统；

• 侵犯脑、脊髓、软脑膜、眼底；

• 多见于免疫抑制的病人；

• EBER+。

专家介绍

万岁桂

首都医科大学宣武医院

首都医科大学宣武医院血液科主任医师、副教授、硕士导师。

任中国免疫学会临床流式细胞术学组常委，中华医学生物免疫学会委员，中华医学生物免疫学会血液学分会委员，中国生物工程学会细胞分析专委会委员。

血液科实验室负责人从事血液临床及实验研究工作30年，自1999年开展流式细胞术恶性血液病免疫分型诊断、微小残留病监测等工作。国内、外发表相关学术论文20余篇，获得国家自然科学基金、北京市留学人员科技择优基金重点项目等资助。