论著 | 结核分枝杆菌膜蛋白MmpS5-MmpL5的表达及功能研究

文章来源：中国防痨杂志，2022，44（3）：227-233.

doi：10.19982/j.issn.1000-6621.20210587

基金资助：国家自然科学基金（81803588）；北京市自然科学基金（7202092）

作者：李东硕，王彬，陆宇，徐建

作者单位：首都医科大学附属北京胸科医院耐药结核病研究北京市重点实验室/北京市结核病胸部肿瘤研究所药物研究室，北京 101149

通信作者: 徐建，Email：xujian198303@hotmail.com； 陆宇，Email：luyu4876@hotmail.com

摘要

目的：表达结核分枝杆菌膜蛋白MmpL5及MmpS5-MmpL5外排泵系统，探讨其在贝达喹啉耐药中的作用。方法：构建结核分枝杆菌外排泵蛋白MmpL5及MmpS5-MmpL5的乙酰胺诱导型表达载体，在耻垢分枝杆菌中诱导表达MmpL5蛋白及MmpS5-MmpL5蛋白，测定表达菌株的生长特性及其外排能力，同时探讨贝达喹啉对表达菌株最小抑菌浓度的变化与对菌体三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）含量的影响。结果：成功在耻垢分枝杆菌中表达结核分枝杆菌膜蛋白MmpL5及MmpS5-MmpL5，表达菌株的生长不受影响，共表达MmpS5-MmpL5蛋白的菌株外排能力增加，导致其对溴化乙锭的积累量（△荧光强度为395）较表达MmpL5蛋白组（△荧光强度为655）和携带pMV261s空质粒组（△荧光强度为642）减少约40%。贝达喹啉对MmpS5-MmpL5重组耻垢分枝杆菌的最低抑菌浓度由0.25 μg/ml提高到2 μg/ml，增加了8倍。贝达喹啉将MmpS5-MmpL5重组耻垢分枝杆菌菌体内ATP含量[（0.197±0.018）μmol/L]降低36.49%[（0.125±0.010）μmol/L]。MmpL5单表达不能形成外排泵，也对贝达喹啉无影响。结论：结核分枝杆菌的膜蛋白MmpL5和MmpS5需要共表达才能在耻垢分枝杆菌中发挥作用，降低贝达喹啉的药物敏感性。MmpS5-MmpL5蛋白表达体系的建立为进行贝达喹啉的具体转运机制研究奠定了基础。

关键词：  分枝杆菌，结核；抗药性；MmpS5-MmpL5；贝达喹啉

贝达喹啉（bedaquiline，Bdq）能够抑制结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）的三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）合成酶,有着重要的灭菌活性，是缩短结核病疗程和治疗耐药结核病的关键新药。2018年，世界卫生组织（World Health Organization，WHO）将Bdq列为治疗耐多药结核病（MDR-TB）或利福平耐药结核病（RR-TB）的A组药物。Bdq的临床耐药株很快出现，迫切需要对其耐药机制进行深入研究，以便在临床大规模使用该药品时，能够合理用药，降低耐药率的发生。

尽管编码ATP合成酶的atpE基因突变与Bdq耐药相关，但在Bdq治疗的临床患者中分离的很少。临床上首先发现且报道最多的是Rv0678基因突变。笔者前期研究也在中国MDR-TB患者中分离到了Bdq和氯法齐明的原发耐药株，发现MTB的Rv0678突变会导致其对Bdq与氯法齐明的交叉耐药。Rv0678基因是MmpS5-MmpL5系统的转录抑制因子，Rv0678基因突变会引起外排泵基因mmpS5及mmpL5的过表达。

MmpL5是多重跨膜的膜蛋白，其蛋白结构尚无解析，MmpS5-MmpL5的功能尚不清楚。膜蛋白的表达与纯化一直是研究膜蛋白功能的技术难题。笔者前期在大肠杆菌中多次尝试表达但结果仍不理想。考虑到耻垢分枝杆菌基因组与MTB高度同源，耻垢分枝杆菌属快生长分枝杆菌且具有无致病性及传染性等优点，笔者采用耻垢分枝杆菌作为模式菌研究，对pMV261载体进行改造，在载体上插入用于调控乙酰胺酶表达的可诱导型启动子，构建了MmpL5和MmpS5-MmpL5蛋白在耻垢分枝杆菌中的表达体系，并对其功能进行了研究，以期为后续蛋白纯化并研究Bdq的转运机制奠定基础。

材料和方法

一、实验菌株

MTB标准株H37Rv（ATCC 27294）和耻垢分枝杆菌Mycobacterium smegmatis  MC2 155（ATCC 700084）由首都医科大学附属北京胸科医院/北京市耐药结核病重点实验室保存并提供。

二、实验药物

Bdq（上海瀚香生物科技公司；批号：20200518；纯度≥98%）、异烟肼（美国Sigma公司；批号：MKBV9475V；纯度≥99%）。

三、 仪器与试剂

1.仪器：Nuaire701二氧化碳恒温培养箱（美国Nuaire公司）、Infinite 200多功能酶标仪（瑞士Tecan公司）、GENEPRO多功能基因扩增仪（杭州博日科技股份有限公司）、Amersham Imager 600蛋白成像仪（美国GE公司）、Max-Q8000低温摇床（美国赛默飞世尔科技公司）、DS-11FX超微量分光光度计（美国DeNovix公司）、Tanon-4200全自动数码凝胶成像系统（上海天能科技有限公司）。

2.试剂：pMV261质粒为本实验室保存；KpnⅠ（R0142V）、BamHⅠ（R0136V）、EcoRⅠ（R0101V）、HpaⅠ（R0105V）、HindⅢ（R0104V）均购自美国纽英伦生物技术公司；E.coli DH5α购自宝生物工程（大连）有限公司（批号：R2015V）；pLB零背景快速连接试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司（批号：VT205）；ATP检测试剂盒（S0026）、特超敏ECL化学发光试剂盒（P0018AS）、苯甲基磺酰氟（PMSF；ST506）、细胞膜蛋白与细胞浆蛋白提取试剂盒（P0033）均购自上海碧云天生物技术有限公司。

四、构建带有组氨酸标签的乙酰胺诱导型载体pMV261s

采用PCR的方法从耻垢分枝杆菌中扩增乙酰胺酶基因，引物序列如下：AI-F：5'-ctaggtaccagtgacgcggtctcaagcg-3'（KpnⅠ），AI-R：5'-ctaggatcc-aaaactacctcgggcatgtgg-3'（BamHⅠ），下划线处为酶切位点。PCR反应后目的基因与pLB克隆载体连接，目的片段经琼脂糖凝胶电泳回收与pMV261载体双酶切后连接。设计一段在N端含有6×His组氨酸标签的序列，并引入BamHⅠ及HpaⅠ的酶切位点黏性末端，序列如下：261-F：5'-gatcctcaccaccaccaccaccacactagtcagctgcagaattcatatgcatcgatggtt-3'（斜体标示序列为6×His组氨酸标签序列）；261-R：5'-aaccatcgatgcatatgaattctgcagctgactagtgtggtgg-tggtggtggtgag-3'，将上述质粒经BamHⅠ及HpaⅠ双酶切后，与此序列连接,构建带有组氨酸标签的乙酰胺诱导型载体，命名为pMV261s。

五、目的基因与pMV261s的连接及转化

根据NCBI中MTB标准株H37Rv的mmpS5及mmpL5的基因序列设计引物，引物序列如下：mmpS5-F：5'-ccggaattcgatgattggaactctcaagc-3'和mmpL5-F：5'-ccggaattcgatgatcgtgcaaaggac-3'（EcoRⅠ） ；mmpL5-R：5'-ccggttaactcagaccaaggcgaagg-3'（HpaⅠ）；构建mmpS5-mmpL5全长基因，前引物为mmpS5-F，后引物直接为mmpL5-R。PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳，切胶回收，pLB载体过夜连接提取目的基因。EcoRⅠ及HpaⅠ双酶切的目的基因与pMV261s载体连接，转化连接产物至E.coli DH5α大肠杆菌感受态细胞，挑取阳性克隆并测序验证。

将测序验证正确的含mmpL5及mmpS5-mmpL5基因的质粒及空质粒电转入耻垢分枝杆菌感受态细胞，电转条件为电压2500 V、电容25 μF，电阻1000 Ω，电转化杯厚度2 mm。转化后于含10% OADC添加剂的7H9培养基中37 ℃恒温摇床继续培养4 h，吸取一定体积涂布在含终浓度为50 μg/ml的卡那霉素的LB平板上，挑取单克隆于7H9＋10% OADC＋50 μg/ml卡那霉素培养基培养。

六、MmpL5及MmpS5-MmpL5蛋白的表达

待菌液培养至波长600 nm处吸光度值（A600值）等于0.8，加入终浓度为0.2%的乙酰胺溶液诱导蛋白表达，37 ℃条件下继续培养20 h，收集诱导表达后的菌液，离心后弃上清，菌沉淀用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）重悬，离心弃上清，菌沉淀加入细胞膜蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂A和PMSF，悬浮后冰浴10～15 min，高压破碎仪破碎菌体，4 ℃ 1200×g离心10 min，收集上清液，继续14 000×g离心30 min，吸除上清，沉淀加入膜蛋白抽提试剂B，振荡后冰浴14 000×g离心 5 min，抽提膜蛋白。

七、蛋白免疫印迹分析

提取的蛋白进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），转移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，用含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液封闭2 h，加入1∶2000的抗组氨酸鼠源IgG单克隆抗体一抗，TBST缓冲液洗去一抗，加入1∶5000的羊抗鼠IgG二抗孵育，TBST缓冲液洗去二抗，加入辣根过氧化物酶显色剂孵育后，进行化学显色检测。

八、生长曲线的测定

为了验证外源基因表达对耻垢分枝杆菌生长的影响，测定了空质粒、表达MmpL5及MmpS5-MmpL5的菌株的生长曲线。将这3种细菌培养至对数生长期后，调整A600值一致，之后按1%接种在含0.05%吐温-80的7H9+10%OADC培养基中，37 ℃恒温摇床继续培养，每隔5 h测定1次A600值，每个样品设置2个生物学重复，绘制生长曲线。

九、检测抗菌药物对耻垢分枝杆菌的最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）

将3种细菌培养至对数生长期，用7H9＋10%OADC培养基将菌液稀释至终浓度为1×105 CFU/ml。取96孔黑色培养板，依次将异烟肼及Bdq倍比稀释。37 ℃培养3 d后，各孔加入20 μl的阿尔玛蓝和12.5 μl的20%吐温-80，37 ℃继续培养24 h，记录各孔颜色，蓝色表示菌株无生长，红色表示有菌生长，MIC表示由蓝色变为红色的的最低药物浓度。

十、耻垢分枝杆菌对溴化乙锭（ethidium bromide，EtBr）的积累实验

MmpS5-MmpL5蛋白属于RND超家族外排泵，EtBr常被用作测试药物外排泵活性的通用型底物。离心收集培养至对数生长期的3种细菌，并用PBS重悬洗涤菌体2次，调节各菌A600值为0.4，吸取198 μl重悬菌液，加入2 μl浓度为100 μg/ml的EtBr至终浓度为1 μg/ml，混匀，立即用Infinite M200多功能酶标仪检测荧光值，设置激发波长为545 nm，发射波长为590 nm，每隔5 min检测1次，共检测60 min，设置3个生物学重复。

十一、耻垢分枝杆菌ATP含量测定

取培养至对数生长期的3种细菌，用7H9培养基调节A600值为0.4，向菌液中加入终浓度为1/2 MIC（0.125 μg/ml）的Bdq，孵育24 h，离心收集等体积的3种细菌，离心后弃上清，菌沉淀加入裂解液，振荡混匀。96孔黑色培养板中加入100 μl裂解菌液和100 μl稀释后的ATP检测液，酶标仪测定相对光单位（relative light unit，RLU）值，根据标准曲线及测定的RLU值计算出各菌液中的ATP含量。

十二、统计学处理

使用SPSS 26.0软件进行数据处理及分析，计量资料符合正态分布，采用“x¯±s”描述，多组间差异的比较采用单因素方差分析，进一步的组内两两比较采用student t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结   果

一、带有组氨酸标签的乙酰胺诱导型载体pMV261s的构建

通过改造pMV261穿梭载体，添加乙酰胺酶启动子基因（pACE），并添加组氨酸标签便于重组蛋白的验证及纯化，建立带有组氨酸标签的乙酰胺可诱导型表达载体pMV261s。对耻垢分枝杆菌乙酰胺酶启动子基因进行PCR扩增，片段长度为2618 bp（图1），连接pLB克隆载体成pLB-pACE，KpnⅠ及BamHⅠ双酶切后目的条带大小正确（图2），在乙酰胺酶启动子基因上有HindⅢ酶切位点，在含组氨酸标签的序列上有EcoRⅠ酶切位点，双酶切后片段长度为1584 bp（图3）。由此证明组氨酸标签连接成功，同时测序验证正确，pMV261s载体构建成功。

二、pMV261s-mmpL5和pMV261s-mmpS5-mmpL5表达载体的构建

PCR方法扩增MTB的mmpL5及mmpS5-mmpL5基因，mmpL5片段长度为2895 bp，mmpS5-mmpL5片段长度为3320 bp，目的基因条带大小正确（图4），EcoRⅠ和HpaⅠ双酶切目的基因及pMV261s表达载体，双酶切条带大小正确（图5，6），测序结果无突变。

三、MmpS5-MmpL5及MmpL5蛋白在耻垢分枝杆菌中的表达

对经乙酰胺诱导的pMV261s-mmpL5、pMV261s-mmpS5-mmpL5重组菌株及pMV261s空质粒菌株进行蛋白免疫印迹分析，MmpL5蛋白相对分子质量为104 800，MmpS5-MmpL5蛋白相对分子质量为120 100，加上6×His组氨酸标签组成的重组蛋白，在相对分子质量为110 000～130 000处出现目的条带，而空质粒菌株没有条带（图7），表明MmpL5及MmpS5-MmpL5蛋白在耻垢分枝杆菌中成功表达。

四、MmpL5和MmpS5-MmpL5蛋白的表达对耻垢分枝杆菌生长无影响

为考察MmpL5和MmpS5-MmpL5蛋白的表达是否影响耻垢分枝杆菌的生长特性，比较3种细菌的生长曲线，发现表达mmpL5及mmpS5-mmpL5基因的耻垢分枝杆菌与携带pMV261s空质粒的耻垢分枝杆菌，均在15 h之后进入对数生长期，25 h达到平台期，三者生长特性没有明显差异（图8）。

五、Bdq对表达MmpS5-MmpL5蛋白的耻垢分枝杆菌的敏感性降低

异烟肼对表达MmpL5及MmpS5-MmpL5蛋白的重组耻垢分枝杆菌及携带空质粒的耻垢分枝杆菌的MIC均为1 μg/ml，表明异烟肼不是MmpS5-MmpL5蛋白外排系统的底物。Bdq对表达MmpL5蛋白及带有空质粒的耻垢分枝杆菌的MIC值为0.25 μg/ml，而对表达MmpS5-MmpL5蛋白的耻垢分枝杆菌的MIC为2 μg/ml，MIC值提高了8倍。由此证明，MmpL5与MmpS5蛋白共表达才能发挥作用，且MmpS5-MmpL5蛋白的表达导致Bdq的耐药。

六、表达MmpS5-MmpL5蛋白的耻垢分枝杆菌外排能力增强

检测重组耻垢分枝杆菌对EtBr的积累，发现表达MmpL5蛋白与携带有pMV261s空质粒的耻垢分枝杆菌对EtBr的积累大致相同（△荧光强度值分别为655和642），而表达MmpS5-MmpL5蛋白的耻垢分枝杆菌对EtBr的积累）（△荧光强度值为395）较MmpL5组和pMV261s空质粒组减少约40%（表1），说明MmpS5-MmpL5蛋白具有外排能力，而没有MmpS5的MmpL5蛋白不能形成外排泵。

七、Bdq对表达MmpS5-MmpL5蛋白的耻垢分枝杆菌体内ATP含量影响较小

使用1/2 MIC浓度的Bdq作用24 h后，比较药物作用前后菌体内ATP含量的变化。Bdq作用前表达MmpL5蛋白组菌体ATP水平[（0.193±0.028）μmol/L)]、表达MmpS5-MmpL5蛋白组菌体ATP水平[（0.197±0.018）μmol/L]与携带pMV261s质粒组菌体ATP水平[（0.181±0.013）μmol/L]相比，差异无统计学意义（F=0.539，P=0.609）。Bdq作用后，表达MmpL5蛋白组菌体ATP水平[（0.056±0.009）μmol/L]与pMV261s空质粒组菌体内ATP水平[（0.055±0.008）μmol/L]相比，差异无统计学意义（F=62.914，P=0.929）。药物作用后，表达MmpS5-MmpL5蛋白的重组耻垢分枝杆菌内ATP水平[（0.125±0.010）μmol/L]降低36.49%，而表达MmpL5蛋白组菌体ATP水平降低71.21%，空质粒组菌体ATP水平降低69.49%，表达MmpS5-MmpL5蛋白组菌体ATP水平明显高于表达MmpL5蛋白组和空质粒组，差异有统计学意义（F=5.172，P=0.049）。这提示MmpS5与MmpL5蛋白作为复合体导致菌体外排Bdq能力增加，使Bdq作用于ATP合成酶的量减少，从而使菌体内ATP水平下降较少。

讨    论

外排泵能够将菌体内药物泵出，外排泵过表达使得菌体内药物浓度不能有效抑制分枝杆菌生长，是MTB耐药的重要原因之一。MmpL是分枝杆菌基因组编码的一组膜蛋白，属于外排泵RND蛋白超家族，在脂质、聚合物和免疫调节剂的运输过程中发挥重要作用。笔者团队前期研究发现，Bdq和氯法齐明对Rv0678突变的MTB交叉耐药，Rv0678突变导致mmpL5和mmpS5表达的上调。近年研究表明，MmpS5-MmpL5系统也可以转运分枝菌素。MTB编码13种MmpL蛋白，其中，MmpL5蛋白（Rv0676c基因编码）由964个氨基酸组成，理论相对分子质量为104 800，由12个跨膜结构域及2个周质结构域组成。附属蛋白MmpS5（Rv0677c基因编码）由142个氨基酸组成，理论相对分子质量为15 200。mmpL5在转录上与mmpS5基因相偶联，二者位于同一操纵子内，受下游的转录抑制因子Rv0678的调控。Andries等在MTB中单独过表达MmpS5蛋白没有改变Bdq对其的MIC值，提示单一的MmpS5蛋白对药物外排无影响，因此，本研究中没有单独构建MmpS5蛋白。

膜蛋白的表达与纯化一直是蛋白研究的技术难题，笔者课题组前期在BL21plys大肠杆菌及C43大肠杆菌中多次尝试表达膜蛋白MmpL5蛋白都未能获得理想结果，可能是外源膜蛋白在大肠杆菌中的毒性、错误折叠、聚集等导致表达量低。MTB的MmpL5与耻垢分枝杆菌同源MSMEG_1382的序列相似性为62.96%，表明MmpL5蛋白表达相应的条件在耻垢分枝杆菌可能具备。耻垢分枝杆菌无传染性和致病性，生长较快、操作较为容易。这些特点都是耻垢分枝杆菌作为表达宿主菌的优势。乙酰胺酶启动子是一种强启动子，在耻垢分枝杆菌中受到严谨调控，诱导后高水平表达。Zhang等利用乙酰胺酶启动子构建了MmpL3表达载体，成功实现了在耻垢分枝杆菌中表达和纯化。本研究通过改造pMV261穿梭载体，建立了带有组氨酸标签的乙酰胺诱导型表达载体pMV261s-mmpL5和pMV261s-mmpS5-mmpL5，蛋白免疫印迹验证了蛋白在耻垢分枝杆菌的成功表达。

本研究通过Bdq对3种重组菌株的药物敏感性试验发现，共表达MmpS5-MmpL5蛋白的耻垢分枝杆菌会降低Bdq对其的活性，而仅表达MmpL5蛋白的重组耻垢分枝杆菌对Bdq的药物敏感性无影响。这与Yamamoto等发现MmpS5促使MmpL5蛋白单聚体组装成三聚体发挥功能的结果一致。EtBr是一种荧光染料，是多数外排泵的转运底物，通常被用作测试药物外排泵活性的通用型底物。重组耻垢分枝杆菌对EtBr的积累实验表明，MmpS5-MmpL5蛋白表达比MmpL5蛋白单独表达和空质粒组对EtBr的积累量较少，其外排能力增加。单独MmpL5蛋白表达与空质粒相比没有差异，进一步说明MmpS5和MmpL5蛋白共表达形成外排泵，发挥生物学功能。贝达喹啉的作用靶点是ATP合成酶，进而导致菌体内的ATP合成减少而发挥抗菌作用。为了考察Bdq通过MmpS5-MmpL5蛋白外排影响菌体内ATP水平，笔者在1/2 MIC浓度的Bdq作用下，发现共表达MmpS5-MmpL5蛋白的耻垢分枝杆菌菌体内ATP含量较表达MmpL5蛋白和携带空质粒组变化小。结合MmpS5-MmpL5蛋白共表达导致的外排能力增强，表明MmpS5-MmpL5蛋白外排系统以Bdq为底物，通过增加Bdq的外排量使菌体内Bdq的含量降低，进而使Bdq抑制靶点ATP合成酶的量减少，导致菌体内ATP水平的变化较少。

综上所述，笔者构建了MTB的膜蛋白MmpL5及外排泵MmpS5-MmpL5在耻垢分枝杆菌中的表达体系。功能实验也表明了MmpS5-MmpL5蛋白共表达形成外排泵发挥作用，降低Bdq的药物敏感性。本研究深化了对Bdq耐药机制的理解，而膜蛋白表达体系的建立为蛋白的纯化和进一步研究Bdq的转运机制奠定了基础。

（参考文献略）

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编辑：孟    莉

审校：范永德

发布日期：2022-04-01

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