疫苗强化免疫方案对T细胞长期免疫记忆的影响

研究背景

T细胞介导的免疫应答在宿主抵御结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）感染中发挥重要作用。卡介苗（Bacillus Calmette-Guérin，BCG）是唯一获得临床许可的结核病疫苗。新生儿接种BCG可预防儿童罹患严重的结核病，但对成年人缺乏有效的保护。其中的原因可能是BCG主要诱导的是效应记忆T细胞介导的免疫应答，而不能提供长期的抗结核免疫保护。BCG初免-亚单位疫苗加强免疫的策略被认为是提高成人免疫力的一种可行途径。然而，在亚单位疫苗加强BCG的动物实验和临床试验中，多个亚单位疫苗强化免疫方案并未诱导获得长期的免疫保护。因此，迫切需要研究如何在BCG免疫基础上利用亚单位疫苗诱导长期存活的记忆T细胞，从而增强长期的抗结核免疫保护。

研究方法

1.疫苗制备：构建及纯化重组结核分枝杆菌融合蛋白ESAT6-CFP10（EC）和Mtb 10.4-HspX（MH）。佐剂为双十八烷基二甲基溴化铵（DDA）和聚肌胞苷酸（Poly I:C）的混合物（DP）。MH和EC分别与DP混合制备成MH/DP和EC/DP疫苗，分别代表BCG抗原和BCG缺失抗原构成的亚单位疫苗。

2.免疫方案：将6～8周龄C57BL/6小鼠皮下接种BCG（5×105 CFU/只）免疫后，进行两种免疫方案实验。（1）长免疫间隔方案：使用MH/DP和EC/DP疫苗分别在第12、24周和第12、16、24周进行加强免疫或免疫；同时分别以第24周加强1次BCG免疫组及磷酸盐缓冲液（PBS）和BCG初次免疫组（仅免疫一次）作为强化免疫的对照。（2）短免疫间隔方案：MH/DP和EC/DP分别在第8、14周和第8、10、14周进行加强免疫或免疫，以PBS和BCG初次免疫组（仅免疫一次）为对照。

3.免疫检测：于末次免疫后的第12周和28周分别进行免疫检测，主要检测记忆T细胞介导的免疫应答。具体如下：（1）流式细胞术检测脾脏CD4+和CD8+ T细胞分泌白细胞介素2（IL-2）、γ-干扰素（IFN-γ）的比例与细胞数。（2）延长酶联免疫斑点试验（ELISPOT）检测脾细胞长期记忆T细胞的数量。（3）抗原两次重复刺激后，流式细胞术检测脾细胞产生IFN-γ的CD4+和CD8+ T细胞比例，以反映长期存活记忆性T细胞的功能。（4）细胞增殖检测试剂盒（EdU法）检测脾脏CD4+ T细胞的增殖能力。（5）疫苗末次免疫后的第17周或19周，应用H37Ra菌株经呼吸道感染小鼠，以评价疫苗诱导免疫记忆的保护作用。

研究结果

1.BCG活化效应记忆T细胞维持时间分析：在脾淋巴细胞中，BCG免疫后的第4周，CD4+ T细胞产生IFN-γ的比例最高，第9周时略有下降，第12周时免疫反应降至低水平。在骨髓淋巴细胞中，BCG免疫后的第4周，CD4+ T细胞产生IFN-γ的比例增加，第9周时达到最高水平，第12周时下降。表明BCG免疫后的第12周，效应记忆T细胞的应答水平降低。

2.不同免疫接种方案对T细胞分泌细胞因子的影响：疫苗末次免疫后的第12周，与MH/DP在12-16-24周加强组（0.82%±0.46%）和EC/DP在12-24周免疫组（0.61%±0.21%）相比，MH/DP在12-24周加强组的CD4+ T细胞分泌IFN-γ的比例（1.97%±0.70%）显著增加（P值均＜0.05）。与BCG加强组（0.36%±0.15%）相比，MH/DP在12-24周加强组（0.88%±0.32%）和EC/DP在12-16-24周免疫组（1.33%±0.56%）的CD8+ T细胞产生更多的IFN-γ（P值均＜0.05）。与BCG组（2.67%±0.70%）相比，EC/DP在12-16-24周免疫组（5.84%±1.41%）的CD4+ T细胞产生IL-2的比例增多（P＜0.05）。此外，与MH/DP在12-16-24周加强组相比，EC/DP在12-16-24周免疫组的CD4+和CD8+ T细胞产生IFN-γ/IL-2的细胞数目均增多（P值均＜0.05）。具体见图1。

图1  不同免疫接种方案小鼠脾脏淋巴细胞产生IFN-γ和IL-2的比例和数量。A：CD4+ 和CD8+ T细胞分泌IFN-γ和IL-2的流式细胞术分析。B：CD4+ 和CD8+ T细胞分泌IFN-γ和IL-2的统计学分析。C：CD4+ 和CD8+ T细胞分泌IFN-γ和IL-2的细胞数的统计学分析。每组4～5只小鼠。*：P＜0.05，**：P＜0.01

3.不同免疫接种方案对长期存活记忆T细胞产生IFN-γ的影响：末次免疫后的第28周，延长ELISPOT检测结果表明，与EC/DP在12-24周免疫组[（86.2±33.7）SFCs/5×106个细胞）]相比，MH/DP在12-24周加强组[（166±22.4）SFCs/5×106个细胞]诱导了更多数量的分泌IFN-γ的抗原特异性长期存活记忆T细胞（P＜0.05）。此外，与MH/DP在12-16-24周加强组[（73±52）SFCs/5×106个细胞]相比，EC/DP在12-16-24周免疫组[（162.25±18.3）SFCs/5×106个细胞]显著增加了分泌IFN-γ的抗原特异性长期存活记忆T细胞的数目（P＜0.05）（图2A和2B）。

根据延长ELISPOT检测原理，在抗原重复刺激下，以流式细胞术检测长期存活记忆T细胞的免疫应答。结果显示，与EC/DP在12-24周免疫组（1.59%±0.34%）和MH/DP在12-16-24周加强组（1.00%±0.38%）比较, MH/DP在12-24周加强组（3.58%±0.37%）的CD4+ T细胞分泌IFN-γ的比例均明显增高（P值均＜0.05）（图2C和2D）；与MH/DP在12-16-24周加强组（1.00%±0.38%）相比，EC/DP在12-16-24周免疫组（3.27%±1.21%）的CD4+ T细胞分泌IFN-γ的比例增加（P＜0.05）（图2C和2D）；与EC/DP在12-24周免疫组相比，MH/DP在12-24 周加强组分泌IFN-γ的CD4+ T细胞数量更多（P＜0.05）（图2E）。与EC/DP在12-24周免疫组相比，EC/DP在12-16-24周免疫组的CD4+ T细胞分泌IFN-γ的数目增加（P＜0.05）（图2E）。这些结果表明，MH/DP在12、24周时加强2次免疫和EC/DP在12、16、24周时免疫3次均可提高长期存活记忆T细胞的免疫应答能力。

图2  延长ELISPOT和流式细胞术检测长期存活记忆T细胞分泌IFN-γ的能力。A：延长ELISPOT检测的代表性图。B：延长ELISPOT 检测的统计学分析。C：CD4+ 和CD8+ T细胞分泌IFN-γ的流式细胞术分析。D：CD4+ 和CD8+ T细胞分泌IFN-γ的统计学分析。E：来自每个免疫组的总脾脏淋巴细胞中分泌IFN-γ的T细胞数量的统计学分析。每组4～5只小鼠。*：P＜0.05

4.不同免疫接种方案对长期存活记忆T细胞增殖能力的影响：末次免疫后的第12周，与BCG组（1.28%±0.46%）和BCG加强组（1.17%±0.45%）相比，MH/DP在12-24周加强组（2.18%±0.32%）中EdU+增殖的细胞比例均显著增加（P值均＜0.05）；与MH/DP在12-16-24周加强组（1.42%±0.63%）比较，MH/DP在12-24周加强组（2.18%±0.32%）和EC/DP在12-16-24周免疫组（2.00%±0.36%）中EdU+细胞比例均显著增加（P值均＜0.05）（图3A和3C）。

末次免疫后的第28周，与BCG组（0.98%±0.40%）和BCG加强组（0.71%±0.57%）相比，MH/DP在12-24周加强组（2.83%±0.57%）和EC/DP在12-16-24 周免疫组（3.33%±0.39%）中EdU+ 细胞的比例均显著增加（P值均＜0.05）；与MH/DP在12-16-24周加强组（1.20%±0.78%）和EC/DP在12-24周组免疫组（1.89%±0.82%）相比，MH/DP在12-24周加强组（2.83%±0.57%）中EdU+ 细胞的比例均更多（P值均＜0.05）（图3B和3D）。总之，MH/DP在12、24周时加强2次免疫和EC/DP在12、16、24周时免疫3次都增强了CD4+ T细胞的增殖能力。

图3  疫苗免疫后CD4+ T细胞的增殖能力评价。A、B：CD4+ T细胞增殖的流式细胞术分析。C：末次免疫后12周，CD4+ T细胞增殖能力统计学分析。D：末次免疫后28周，CD4+ T细胞增殖能力统计学分析。每组4～5只小鼠。*：P＜0.05

5. MH/DP在12-24周加强免疫和EC/DP在12-16-24周免疫可诱导长期免疫保护作用：MH/DP在12-24周加强组和EC/DP在12-16-24周免疫组疫苗末次免疫后的第19周，经小鼠呼吸道感染H37Ra菌株，检测疫苗诱导免疫记忆的抗感染作用。

与PBS对照组相比，BCG组和MH/DP加强组或EC/DP免疫组中肺组织的菌载量均显著降低（P值均＜0.001）。MH/DP在12-24周加强组和EC/DP在12-16-24周免疫组中均降低了肺组织中的细菌负荷，与BCG组相比两组均降低了约0.1log10 CFU（P值均＜0.05）（图4A）。然而，BCG免疫后，MH/DP在第8、14周时加强免疫2次和EC/DP在第8、10、14周时免疫3次，均在末次免疫后的第17周，经小鼠呼吸道感染H37Ra菌株，并未发现这8-10周加强组和8-10-14周免疫组可改善疫苗诱导记忆T细胞的免疫保护（图4B）。结果表明，MH/DP在12-24周加强方案和EC/DP在12-16-24周加强方案均促进了长期存活记忆T细胞介导的免疫保护。

图4  不同强化方案的保护效应评价。A：长免疫接种间隔。末次免疫后19周，结核分枝杆菌H37Ra 滴鼻方式感染小鼠。B：短免疫接种间隔。末次免疫后17周，用H37Ra滴鼻方式感染小鼠。感染后3周，对小鼠实施安乐死后测量肺部的细菌负荷。每组4～6只小鼠。*：P＜0.05，***：P＜0.001

研究结论

BCG免疫后，BCG抗原MH/DP在12-24周组加强免疫2次和BCG缺失抗原EC/DP在12-16-24周组免疫3次可以促进结核亚单位疫苗诱导T细胞长期免疫记忆。

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