Nature：首个人类造血干细胞发育路线图，助力造血干细胞体外培育

撰文 | 协和小卒  

来源 | 丁香学术  

造血干细胞   （haematopoietic stem cells, HSC）   具有无限复制自身并分化成人体内各种血细胞的能力。几十年来，医生们一直在用捐献者骨髓和新生儿脐带内的造血干细胞进行移植，以治疗血液病和免疫系统疾病。然而，由于缺乏匹配的供体，且脐带血中干细胞数量较少，这些治疗也受到了限制。  

研究人员试图利用人类多能干细胞在体外诱导生成造血干细胞，从而克服供体的局限性。然而，目前却依然无法实现，部分原因在于现阶段科学家只能将实验室培养的细胞分化成短寿命的造血祖细胞，而不是具有自我更新能力的造血干细胞。  

然而，人类 HSC 产生的具体步骤尚不明确，因此也限制了从人类多能干细胞   （hPSCs）   诱导分化为能够移植的 HSC，同时限制了某些疾病模型的建立和相关研究的开展。  

2022 年 4 月 13 日，美国加州大学洛杉矶分校的研究团队   创建了一份史无前例的造血干细胞发育路线图，追踪了人类胚胎中造血干细胞发育的每一步，为人们在实验室中生产功能齐全的造血干细胞提供了蓝图   。该研究以：   Mapping human haematopoietic stem cells from haemogenic endothelium to birth   为题发表在国际顶尖学术期刊   Nature   上。  

通过创建人类造血发生的单细胞转录组图谱，他们记录了 HSC 从动脉造血内皮细胞产生的全过程，并使用空间转录组学可视化主动脉内造血群（Intra-Aortic Haematopoietic Clusters, IAHCs）中 HSC 的产生。此外，通过比较不同成熟阶段的 HSC，建立了 HSC 出现后的转录因子机制，揭示了其表面分子标志物在整个发育过程中的不断演化。  

通过建立人类 HSC 发育的详细分子图谱，将有助于理解 HSC 的来龙去脉以及某些血液疾病的分子机制，同时也为在体外生成全功能性 HSC 奠定了基础。  

新生人类 HSC 的分子特性  

为了鉴定新生的人类 HSC，他们对来自三个 Carnegie stage 14-15   （CS 14-15）   胚胎主动脉-性腺-中肾   （aorta-gonad-mesonephros, AGM）   区域的 CD34+ 和 CD31+ 造血和内皮细胞进行了单细胞转录组测序   （scRNA-seq）   ，并从中鉴定了一个具有人类 HSC 预期特征的亚群。其中，HLF 的表达对 HSC 群最具特异性。  

为了识别新生 HSC 的分子特征，他们将 HSC 亚群与所有其他 AGM 亚群进行了比较分析，并将这些 HSC 富集的分子生成了一个「新生 HSC 特征基因集」。紧接着，为了确定胚胎外或其他胚胎内组织是否含有 HSC，他们对来自 CS14 胚胎的多个组织进行了 scRNA-seq 分析，并寻找共表达 RUNX1、HOXA9、MLLT3、MECOM、HLF、SPINK2   （HSC 富集程度最高的 6 个基因）   的细胞群体，其中 HLF 阳性细胞被认为是可能的 HSC，这些部位包括 AGM、胎盘、卵黄囊、脐带和卵黄囊血管，不过在肝脏、头部和心脏中数量极少。  

总的来说，这些数据表明，HSC 在进入循环系统或定植到肝脏之前，先在胚胎外多个组织中生长。  

肝脏中 HSC 的成熟  

为了确定 HSC 在肝脏定植的时间窗口，他们从不同发育阶段的 AGM 和胎肝单细胞数据中筛选同时表达 HSC 特征基因的细胞亚群，即 RUNX1+HOXA9+MLLT3+MECOM+HLF+SPINK2+ 细胞亚群。其中 HLF 阳性 HSC 定量分析显示 HSC 向肝脏的定植发生在孕 6 周。  

接下来，研究人员系统地评估了 HSC 的成熟度。对 HLF 阳性 HSC 的伪时序分析发现了 HSC 成熟过程中的时间调控程序。其中，与胚胎发育相关的基因、增殖活性、氧化磷酸化、葡萄糖和核苷酸代谢等相关基因在肝细胞 HSC 中逐渐受到抑制，反映了其向稳态的转变；而那些抗原呈递类基因则在 HSC 成熟过程中显著上调，尤其是 MHC II 类基因。肝、脐带血的流式细胞术分析也证实了 HLA-DR 和 PROM1 表达的增加，可作为人类 HSC 成熟的标志。  

HSC 起源于动脉内皮细胞  

为了确定人类 HSC 的细胞前体，他们在 UMAP 降维图中评估了 CS14-15 AGM 中造血细胞和内皮细胞之间的联系。结果发现 GJA5 阳性动脉内皮细胞到 HSC 的发展轨迹是直接的，而与其他造血细胞则并不如此。此外，CDH5+RUNX1+CD45− 的生血内皮细胞则是连接动脉和 HSC 的细胞亚群。  

在内皮-造血转化   （EHT）   期间，通过伪时间变量的无监督聚类分析揭示了精确时间窗口的调节开关。生血内皮细胞显示了从内皮细胞到造血细胞转录程序的过渡，并且由代谢静息为特征，即 TGFβ/BMP 和 Notch 信号通路在 HSC 出现后下降。  

体外生成 AGM 样造血干细胞和祖细胞（HSPC）  

为了评估人类多能干细胞向 HSC 的分化并识别其体内的对应细胞，他们对体外生成的血细胞同样进行了 scRNA-seq 分析。以人类体内造血细胞的 scRNA-seq 数据为参考，结果发现 HLF+SPINK2+ 造血干祖细胞与体内未成熟的 AGM 和胚胎外 HSC 比较相似，这也通过 HSC 富集基因的表达得到了证实。但是很遗憾的是，在体外仍然无法产生功能性成熟的 HSC。  

不过作者表示，通过体内外数据的比较，鉴定在 EHT 期间的分子差异可能会进一步解决体外生成功能性 HSC 的瓶颈。  

综上所述，这项研究建立了一个从早期妊娠到出生前的人类造血干细胞发生的单细胞转录组图谱。通过鉴定数千个单细胞中的基因网络和功能，揭示了这些细胞在胚胎中的位置。它们起源于生血内皮细胞，并在其发育过程中通过不同的位置迁移，从主动脉开始，最终到达骨髓。重要的是，该图谱揭示了它们成熟过程中的重要时间节点，如造血干细胞到达肝脏，并在此获得了对其功能维持具有重要作用的成分。  

本研究通讯作者 Hanna K. A. Mikkola 教授将造血干细胞比作外科医生，正如外科医生需要经历不同阶段的培训来学习如何进行手术一样，未成熟的血液干细胞必须通过不同的位置来学习如何完成造血干细胞的工作。  

这一研究成果还将帮助研究人员了解造血干细胞和造血祖细胞之间的根本差异，这对于创造适合用于移植疗法的细胞至关重要。Mikkola 说到：「以前，我们试图从多能干细胞中培育出造血干细胞，但它们并没有移植重建能力，我们并不知道在这一过程中哪里失败了。现在，可以将细胞置于我们发布的 HSC 生成路线图中，看看我们在哪里取得了成功，哪里存在不足，并根据体内数据的指示调整诱导分化过程。」  

Vincenzo Calvanese（左）和 Hanna Mikkola（右）自 2012 年以来一直在加州大学洛杉矶分校合作进行血液干细胞研究（图片来源：Eddy Marcos Panos; Reed Hutchinson/UCLA）  

与此同时，该团队创建了一个在线资源库，公开提供研究数据以方便全世界的科学家使用该图谱来指导新的研究工作。期待该研究结果可以帮助我们继续了解胚胎中发育的造血细胞如何导致人类疾病，以及在实验室中制造出可移植的造血干细胞用于疾病治疗。  

在线资源库   ：  

https://singlecell.mcdb.ucla.edu/Human-HSC-Ontogeny/

参考文献   ：  

1． Calvanese, V., Capellera-Garcia, S., Ma, F. et al. Mapping human haematopoietic stem cells from haemogenic endothelium to birth. Nature (2022).  

2. Zeng, Y. et al. Tracing the first hematopoietic stem cell generation in human embryo by single-cell RNA sequencing. Cell Res. 29, 881–894 (2019).  

3. Zhou, F. et al. Tracing haematopoietic stem cell formation at single-cell resolution. Nature 533, 487–492 (2016).