纳米抗体技术学习（上）

纳米抗体及结构简介

1993年，比利时布鲁塞尔自由大学免疫学家Hamers-Casterman教授以及他的同事们在骆驼（骆驼科，后来研究证实也包括单峰骆驼和羊驼）的血清中发现了一种与传统抗体结构不同的新型抗体，这种抗体仅仅由两条重链构成，被称为重链抗体(heavy-chain antibody, HCAb)。重链抗体的重链的可变区称为VHH(variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody)，通过体外重组表达制备的VHH分子质量仅仅为15kDa，是传统抗体的十分之一左右，是抗原结合片段（scFV，VH-VL）的二分之一左右，因此被称为纳米抗体(nanobody, Nb)。



纳米抗体被第一次报道（1993年）由于没有轻链，纳米抗体仅有3个属于重链的抗原识别区域（CDRs 区）。为了弥补缺少的轻链CDRs的生物学活性，纳米抗体在 CDR3部分增加了氨基酸长度（16~18个氨基酸残基，对应的传统抗体的CDR3有8-15个氨基酸），以增加CDR的多样性和特异性。另外，纳米抗体的 CDR3 区域可形成一个大的暴露的凸环，像“手指”一样延伸到抗原的缝隙或者裂口中，可以接触到传统抗体不能接触的抗原表位。CDR3凸环中的一个半胱氨酸还可以与CDR1 或FR2 的 45 位点的半胱氨酸形成二硫键，可使纳米抗体的生物结构相对稳定，大大降低纳米抗体与抗原结合所需能量，使得高亲和力的纳米抗体的获得较容易。



传统抗体（左）、重链抗体（中）和纳米抗体（右）的结构

纳米抗体的优势

1、纳米抗体理化特性较稳定

纳米抗体的生物物理和生化特性特别稳定，包括溶解度、耐热性和蛋白水解抗性等。其CDR3环的折叠和骨架-2区（FR2）域包含了许多亲水性的氨基酸，使其在水溶液中溶解度高，且不易聚集。纳米抗体也具有很好的构象和热稳定性，在37°C条件下1周后仍保持充分的结合能力。除了耐热性，纳米抗体在蛋白酶、促溶剂和极端pH的条件下是稳定的。纳米抗体的稳定性特点可以使其实现不同途径的给药，包括静脉注射、口服和吸入制剂等，其中口服和吸入制剂是传统抗体药物很难实现的药物剂型。如果将纳米抗体用于临床诊断，其在高有机溶剂浓度或pH或温度极端值下的高稳定性为检测小分子或蛋白质提供了极大的便利。

2、纳米抗体的大规模生产较容易实现

传统抗体由于氨基酸序列长、蛋白结构复杂，生产需要复杂的仪器，且只有在真核生物系统中才能实现。另外，在临床抗体药物的使用上，为了达到治疗效果，通常给予大剂量药物。这两方面导致了传统抗体在生产上需要使用大量的哺乳动物细胞和漫长的筛选纯化步骤，生产成本非常昂贵。纳米抗体可以在微生物系统（如细菌、酵母菌、真菌）中大量表达，并且可以通过展示文库中快速筛选，使得纳米抗体具备更低的生产成本优势。

3、纳米抗体免疫原性较低

纳米抗体的结构和人源抗体重链可变区VH结构非常相似，包含三个高变区(hyper variableregion, HVR)和其两侧的四个骨架区(frameworkregion, FR)，且其基因同源性达90%。这意味着纳米抗体的免疫原性比较低，到目前为止，还没有任何关于纳米抗体免疫原性造成的不良反应的报道。



纳米抗体和VH结构示意图

氨基酸序列一级结构示意图（上），菱形块标记的位点为纳米抗体的关键氨基酸，黄色粗线为二硫键。下图分别为VH和纳米抗体的蛋白折叠示意图。

考虑到潜在的安全性风险，在制备成药物时需要将纳米抗体序列进行人源化处理，由于纳米抗体的基因序列较短，通过直接定点突变就可以人源化，跟传统抗体比人源化更容易实现。

4、纳米抗体分子量小，组织渗透能力强，血液清除较快

药物在组织内细胞间的被动扩散速率与药物分子的大小呈反比，因此与传统抗体（150kDa）相比，15 kDa大小的单价纳米抗体的组织穿透性更好，可以到达传统抗体到达不到的病灶组织，如实体瘤等不稳发挥作用；另外，纳米抗体能够有效的穿透血脑屏障，为脑部给药提供了新方法。同时，由于分子量较小，纳米抗体很容易被肾脏快速清除，半衰期较短，极大的避免了毒性作用，有利于其在临床影像技术的应用。但是同时半衰期短限制了其作为治疗药物的使用，可以通过聚乙二醇化、与白蛋白结合或融合、与抗体的Fc融合的手段延长半衰期。5、纳米抗体可以识别传统抗体不能识别的位点由于纳米抗体较小的尺寸以及特殊的CDR3结构，促进了其与传统抗体所不能达到的新表位的相互作用，因此纳米抗体具备结合和中和传统抗体难以命中的靶点的能力。



纳米抗体（左）和人源抗体（右）CDR结构比较

6、纳米抗体具备形成多聚体的能力

由于纳米抗体分子量小，单体之间黏连性弱，很容易通过基因工程手段将多个纳米抗体单体串联表达，实现多聚体。如果纳米抗体被设计成临床治疗药物，这一特性可以得到多价抗体和双特异抗体，增强抗体跟抗原的结合能力。同时，利用这一特性，还可以通过多聚体或者耦联一个抗血清蛋白的纳米抗体来增加纳米抗体的半衰期。

纳米抗体的筛选和制备

纳米抗体的筛选和制备

上：利用噬菌体展示技术进行纳米抗体的前期筛选；下：从筛选到纳米抗体的制备过程。

1、纳米抗体基因文库的构建

抗原特异的纳米抗体可以通过免疫库、天然库或合成库产生，其中免疫库的构建常用的纳米抗体开发技术。

用纯化的靶抗原对羊驼进行免疫，免疫成功后在羊驼血液中提取包含成熟B细胞的淋巴细胞。抽提淋巴细胞的RNA并反转成cDNA文库，利用特殊设计的引物在cDNA文库中再次进行PCR扩增，得到特异的基因片段；随后将特异的基因片段拼接重组在噬菌体载体上，并转染大肠杆菌，最终完成纳米抗体基因文库的构建。

2、特异性抗体的筛选将靶点抗原或者带有抗原的物质直接/间接的固定在固体载体上，随后加入噬菌体文库和抗原相互作用。作用一段时间后阳性噬菌体会和抗原结合，用洗涤液洗涤固体载体表面，可以将未结合或非特异结合的噬菌体洗去。随后用强酸或者强碱破坏固体载体上抗原和阳性噬菌体的结合，从而得到阳性噬菌体溶液。一般重复进行2-3轮的筛选即可获得符合开发要求的纳米抗体克隆。

3、纳米抗体的生产制备

获得符合要求的抗体克隆后需要进行抗体的大规模生产制备。纳米抗体的生产制备是DNA转录到mRNA然后翻译成蛋白的过程。由于抗体具有复杂的结构，因此在表达体系中需要复杂的细胞器来完成正确的表达、折叠和加工。目前，在工业界有一系列成熟的表达体系可用于抗体表达，不同的表达体系之间各有优劣势差异。抗体设计的最优功能表达和纯化是决定它们实现应用命运的关键因素，因此选择合适的表达体系是获得最大收益的重要环节。

哺乳动物细胞系由于免疫原性低，且其细胞器可提供最优的折叠、分泌和翻译后修饰，是治疗性抗体的首选表达系统，但同时存在生产成本高、技术难度大等缺陷；大肠杆菌表达体系由于其便利的生产和操作、快速的生产周期以及成熟的平台体系最受欢迎，然而，由于氧化氛围和折叠能力的限制，大肠杆菌不能表达具有复杂结构和富含二硫键的重组抗体；酵母是另一个普遍使用的微生物表达宿主，其结合了原核表达系统的优势（周期短、成本低、操作简单）和真核表达系统的优势（正确的折叠、修饰和分泌），使得它成为最受欢迎的可表达全长IgG或者其他抗体形式的宿主。还有其他一些系统可用于表达重组抗体，比如丝状真菌、藻类、原虫、昆虫细胞、转基因植物和动物，其中对转基因植物和动物的研究处于相对初始的阶段，需要进一步的深入研究。对于纳米抗体，由于其结构简单，水溶性较好，因此可以利用成本比较低的细菌表达系统和酵母表达系统进行大量生产。例如，比利时Ablynx公司建立了成熟的毕赤酵母表达和纯化工艺。纳米抗体在哺乳动物细胞系中生产鲜有报道，因为生产成本的昂贵会限制该体系的发展。在植物和动物体内进行纳米抗体生产也有大量的研究报道，跟传统抗体生产体系相似，这两种体系生产的纳米抗体具有成本低、污染少安全性高的特点，具有潜在的应用价值。



参考文献

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Hamers-Casterman C, Atarhouch T, Muyldermans S, et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains[J]. Nature, 1993, 363(6428): 446-448.

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Nguyen V, Su C, Muyldermans S, et al. Heavy-chain antibodies in Camelidae; a case of evolutionary innovation[J]. Immunogenetics, 2002, 54(1): 39-47.

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