解说CRISPR-Cas9 & Base editor的基础结构

魔术剪CRISPR-Cas9何以实现基因编辑？

常用于基因编辑的II型CRISPR系统由三个原件构成：tracrRNA+crRNA嵌合成的sgRNA（a chimaeric single guide RNA）+宿主DNA序列上的PAM（protospacer adjacent motif）+Cas9剪刀（最常用的是酿脓链球菌来源的SpCas9）。sgRNA引导Cas9剪刀到与sgRNA的5’末端碱基互补的（长约20nt的）靶序列protospacer处，紧接这段互补序列下游若存在能被Cas9识别的PAM序列（SpCas9特异性识别的PAM是由3bp组成的NGG序列，N代表任意碱基），Cas9剪刀就会用两个核酸酶结构域HNH和RuvC（在3～4nt upstream of PAM的位点）剪开DNA两条链，最终形成双链断裂double-strandedbreak (DSB)。

Bock,C., Datlinger, P., Chardon, F. etal. High-content CRISPR screening. Nat Rev Methods Primers 2, 8 (2022)

生理条件下，哺乳动物细胞会通过两种方式修复DNA双链的断裂：1.非同源末端连接(nonhomologous end joining,NHEJ) : error-prone mechanism to induce knock out 2.同源重组（homologous recombination, HR）: seal DSB in an error-freehigh-fidelity manner。HR只发生在细胞周期的S期和G2期，此时DNA已经复制，细胞中存在与DSB缺口两端一样的序列，同源重组后DNA能恢复原样。HR也被用于与外源基因载体 (donorDNA) 同源重组，实现外源基因Knock-in。NHEJ可发生在整个细胞周期，相比于HR效率更高 (尤其对处于非有丝分裂中的细胞)，但容易引入几nt的随机插入或缺失（small randominsertions or deletions, indels）,造成基因的扰动（如表达出的蛋白的重要结构域变化或基因的破坏）因此常被用于基因敲除knock-out。总结就是，Cas9剪刀剪完之后宿主DNA主要发生NHEJ，产生随机的indels，造成基因敲除，用于KO。若想把外源基因Knock-in到宿主细胞，要借助宿主效率低但精读较高的HR。

CRISP  R–Cas9Structures a  nd Mechanisms. Fuguo Jiang and Jennifer A. Doudna. Annual Review ofBiophysics 2017 46:1, 505-529

因HR对于DSB的修复效率较低，即对于CRIPSR-Cas9剪刀造成的DSB，细胞常以NHEJ的方式处理。然而NHEJ对于DNA双链的修复又会在剪切位点引入随机的插入或缺失，这对于基因治疗来说无疑是需要避免的。理想的遗传性疾病（genetic diseases）基因治疗方法应该是能够纠正改写错误DNA的铅笔，而不是剪开并扰动DNA的剪刀。

纠正错误碱基的铅笔：Base editor for gene correction without DSBs  

Base editing是基于CRISPR开发出的单碱基编辑技术，由哈佛大学刘如谦教授团队于2016年率先开发，旨在治疗单碱基突变引发的疾病如早衰和镰刀形贫血症。

胞嘧啶碱基编辑器   （cytosinebase editor，CBE）   和腺嘌呤碱基编辑器   (adenosinebase editor，ABE)    由   刘如谦实验室   于2016年和2017年首次开发并   发表在两篇nature上   。CBE可将C·G修改为T·A，ABE可将A·T修改为G·C。  

Nature 533, 420–424 (2016).

Nature 551, 464–471 (2017).

以CBE为例解说剪辑编辑器的构造：PAM + sgRNA+ 由三部分组合而成的融合蛋白（tripartite fused protein）——① a base modification enzyme：能催化胞嘧啶（cytosine）形成尿嘧啶（uridine）的脱氨酶② UGI（Uracil DNA glycosylaseinhibitor）：能抑制宿主胞内尿嘧啶糖苷酶活性的结构。③ Cas9 nickase: 能造成单链DNA nick（single strand DNA breaks）的Cas9剪刀。

BE保留CRISPR Cas9系统指哪剪哪的优势，将C改成T的碱基编辑器主要在Cas9剪刀上做改造。①加胞嘧啶脱氨酶，是为了将C胞嘧啶催化成U尿嘧啶，U进而能被聚合酶识别为T。这种碱基转换的编辑窗   （editingwindow）   大小为5nt，位于protospacer的3~8nt处。②加UGI防止修改产生的U被宿主碱基错配修复机制   （baseexcision repair，mismatch repair，MMR）   打回原形   ，即切除U并补回原本与G互补配对的C。③ 因为改好的U不能与未修改的G继续配对，在后续的DNA复制中我们也不希望能与C配对的G继续存在，所以在含有G的未修改的单链上   （G-containingstrand opposite the newly formed uracil）   制造   DNA nick   （nick the non-edited strand）   ，以诱导宿主细胞的碱基错配修复   （MMR）   把G切补成与U配对的A。  

KomorAC, Badran AH, Liu DR. Editing the Genome Without Double-Stranded DNA Breaks.ACS Chem Biol. 2018 Feb 16;13(2):383-388. 

来源：医药速览 2022-05-06

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