彭华/傅阳心课题组丨 IL-12 融合蛋白

前言：

最近一直在想能不能做一些新的东西，乱七八糟的看了很多文献。前段时间有人提到傅阳心老师组的细胞因子做的很好，我就看了下，确实结构挺有意思。Pro-IL-12添加Fc构建融合蛋白延长半衰期，选择用IL12受体遮蔽IL-12的domain，尽可能避免其在非肿瘤以外的部位发挥作用，等到了肿瘤部位，再由肿瘤组织高表达的MMP14切断相应的linker，释放IL-12发挥作用。给了我一定的启发。      

这篇文章发表在2022年1月7号的《SCIENCE IMMUNOLOGY》,今天就让我们来一起学习这篇文献。

文章题目：A tumor-specific Pro-IL-12 activates preexisting cytotoxic T cells to control established tumors

通讯作者信息：

彭华：现任中国科学院生物物理研究所免疫治疗研究组长,从事病毒与免疫学研究30余年。本科毕业于北京大学医学部，后在美国纽约州立大学布法罗分校和美国国家卫生研究院（LVD/NIAID/NIH）完成病毒学博士和博士后培训。2010年加入中国科学院生物物理研究所，专注于机体抗病毒感染免疫应答机制研究和预防/治疗性病毒疫苗平台的研究与建设。自新冠疫情爆发后，彭华团队紧急研发出一种完全自主知识产权的创新型强效新冠病毒融合蛋白疫苗，已完成I/ II期临床试验，安全有效，正在国外开展III期临床研究。

背景：

白细胞介素 12 (IL-12) 在调节肿瘤免疫环境中起关键作用，包括激活和扩大肿瘤浸润淋巴细胞 (TIL)。然而此前的IL-12开发受到半衰期短和在非肿瘤特异性表达的影响，容易出现剂量相关的细胞因子风暴或肝脏或其他器官组织损伤等严重的副作用。

因此，提高IL12的肿瘤靶向性是一个急需解决的问题。基质金属蛋白酶 (MMP) 是锌依赖性内肽酶，在原发性和转移性肿瘤以及肿瘤相关骨髓细胞中都高表达 。在这项研究中，作者设计了一种新的 Pro-IL-12，它由被 IL-12 胞外受体结合结构域掩蔽的 IL-12 组成，使用 MMP 可切割的接头。这种 Pro-IL-12 可以在 TME 内被优先激活，而全身性后遗症有限。因此，Pro-IL-12 在靶向和治疗肿瘤方面可能比现有的 IL-12 设计更有效，同时降低副作用。

文章思路

Q1 IL-12融合蛋白使用同源二聚体还是异源二聚体哪种合适？

Q2 Pro-IL-12体外活性如何，是不是降低了体内毒性？

Q3 Pro-IL-12对体内肿瘤治疗效果如何？包括转移的肿瘤。

Q4 主要通过什么细胞起作用？是不是T细胞

Q5 哪种因子其关键作用？

Q6 是哪种亚型的T细胞起作用？

Q7 与TKIS联用效果如何？PD-L1抗体呢？

Q8 人源化蛋白在人源化模型中进行再次验证效果如何？

主要内容：

一 IL-12-Fc有效抑制肿瘤生长

IL-12是一种异源二聚细胞因子(75 kDa)，由两个不同的多肽链组成，一个链(p35亚基)和一个链(p40亚基)，它们通过二硫键共价连接。通过与Fc的融合构建融合蛋白延长半衰期，产生两种可能的结构，分别是异源二聚体Hetero-IL-12-Fc和Homo-IL-12-Fc（图A）。

接下来分析了两种结构的优劣，亲和力差不多(图B)，体内治疗肿瘤的效果，Hetero-IL-12效果更好（图C-F），所以选择Hetero-IL-12结构进行后续的药物开发。

上图右边是 Pro-IL-12的结构，它由被 IL-12 胞外受体掩蔽结合域的 IL-12组成，linker是一个MMP-14的底物肽，可以使用 MMP-14切割释放。MMP-14在肿瘤中高表达，因此这种 Pro-IL-12 可以在 TME 内被优先激活，而全身性后遗症有限。因此，Pro-IL-12 在靶向和治疗肿瘤方面可能比现有的 IL-12 设计更有效，同时降低副作用。

二 Pro-IL-12在体外遮蔽了IL-12的活性并且降低了体内毒性

图A可以看到rhMMP14在体外将Pro-IL-12成功切开。

图B可以看到Pro-IL-12被遮蔽结合域以后相比于Hetero-IL-12结合能力出现了显著的下降，图C和D是体内实验的结果，C是刚刚注射完大剂量的药物6h，Pro-IL-12组的血清中INFγ表达量出现了显著的降低，意味着更好的安全性。

从D图结果看，Pro-IL-12相对于对照药体重前后变化不大。

三 Pro-IL-12能有效控制原发性和转移性肿瘤

Pro-IL-12相对于对照组的安全性更好，那么对肿瘤的控制效果会不会更好呢？从A图看，Pro-IL-12实现了其在肿瘤中的优先聚集，以MC38肿瘤小鼠为例，Pro-IL-12有更好的抑制效果，生存率更高（图B和C）。换了不同的肿瘤去观察，尤其是4T1构建的是转移性的肿瘤模型，Pro-IL-12的效果至少不比对照组差。（图D-F）

四、Pro-IL-12发挥作用主要是依赖先前已经存在肿瘤内T细胞

Pro-IL-12到底·是通过哪些免疫细胞发挥作用？

（这真是抗体药永久关注的问题）

图A是野生型的小鼠肿瘤模型，图B是Rag1敲除(KO)小鼠。在图B中药物不起作用可以说明Pro-IL-12是通过适应性免疫抑制中肿瘤的，作者接着又研究了NK和中性粒细胞以及巨噬细胞的影响，发现都不是（补充材料里，有兴趣自己去看吧）。考虑还是T细胞在发挥作用，就用抗CD8抗体和抗CD4抗体中和了这两种T细胞的效果，发现果然药物的效果出现了下降（图C），说明Pro-IL-12依赖这两种细胞，在补充资料里面又进一步考察了，发现主要是依赖CD8+T细胞。     

搞清楚是什么细胞发挥作用以后，又产生一个新的问题。T细胞在很多部位都有，作用的T细胞到底是来自哪里？

FTY720是一种鞘氨苷1-磷酸(S1P)受体激动剂，可以有效限制了T细胞向肿瘤组织的迁移。作者使用FTY720来抑制迁移T细胞进入TME。在FTY720处理下，Pro-IL-12的抗肿瘤作用仍然保持良好(图D)，表明肿瘤已有的T细胞足以满足Pro-IL-12的治疗。

五、IFNγ是Pro-IL-12发挥抗肿瘤作用所必须的

IL-12 与 T 细胞的结合引起了一系列表型变化，包括促炎细胞因子的产生。在 IL-12 诱导的细胞因子中，IFNγ 的表达最高（见补充材料）。为了观察Pro-IL-12对CTLs产生IFNγ的影响，作者分别用Pro-IL-12或PBS对照腹腔注射MC38-OVA小鼠，并用流式细胞术检测肿瘤组织。与PBS组相比，IL -12前处理组第4天肿瘤内CD8+ IFNγ + T细胞的比例和绝对数量均显著增加(图E)。用IFNγ中和抗体中和后，Pro-IL-12的抗肿瘤活性完全消失，肿瘤对Pro-IL-12产生耐药性(图F)。这些结果表明，IFNγ对IL -12诱导的抗肿瘤治疗作用至关重要。

六、CD8+ T细胞上的IL-12R是肿瘤排斥反应所必需的（不是CD4+T细胞）

图A在小鼠体内排除不同类型的细胞可以发现，与PBS对照相比，异源IL -12- fc处理导致大量脾细胞IFN水平显著增加(图A)。这种作用在排除所有T细胞(CD3)后被完全消除，表明NK细胞在产生IFN中的作用有限。与这一发现一致的是，排除NK细胞对IFN没有显著影响。相反，排除CD4+ T细胞(CD4)可使IFN水平降低约30%，排除CD8+ T细胞(CD8)可使IFN水平降低近80%(图A)。这些结果与作者之前的耗损数据一致，表明CD8+ T细胞在肿瘤控制中对IL -12的作用至关重要。

现在又产生一个新的问题？IL-12是直接作用于CD8+ T细胞，还是作用于另一种类型的细胞，如TH1细胞，通过第二信使级联刺激CD8+ T细胞，目前尚不清楚。所以做了图B的实验，结果表面IL-12处理后产生的大部分IFN来自于与CD8+ T细胞的直接结合，只有少量来自于CD4+细胞。

为了证实这一表型在生理上与IL -12的抗肿瘤作用有关，作者用接种MC38的Rag1 KO小鼠做了图C的实验（图D也是），最终发现CD8+T细胞的IL-12Rβ2的表达对于Pro-IL-12在肿瘤抑制中起到关键作用。

总的来说，这些数据表明IL-12R在CD8+ T细胞上的表达不仅对最大程度的IFNγ产生是必要的，而且对体内肿瘤控制也是足够的。

七、Pro-IL-12 与酪氨酸激酶抑制剂联合治疗以诱导强大的肿瘤消退

TUBO是一种HER2/neu依赖性乳腺癌，来源于转大鼠neu癌基因的BALB/c小鼠，是冷肿瘤的代表模型。冷肿瘤是现在肿瘤治疗的一个难点,单用Pro-IL-12无效，如图A，由于TILs不足，对免疫治疗反应较差，研究显示EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)治疗小鼠的TILs显著增加(图B)。因此作者想试试联合用药的效果。

结果显示联合治疗能有效控制肿瘤的生长,预防肿瘤复发,延长小鼠的生存, 并且这种联合治疗的效果是T细胞依赖性的(图C和D)。作者的数据表明，Pro-IL-12可以通过T细胞依赖的方式克服晚期EGFR/HER2依赖性肿瘤患者对TKIs靶向治疗的耐药性。

八、Pro-IL-12 与PD-L1抗体联合治疗以诱导强大的肿瘤消退

免疫检查点阻断(ICBs)，如PD-1/PD-L1抗体，因其对多种肿瘤的疗效而被广泛认可，但许多患者甚至在最初反应后也产生了耐药性。单独的ICB不足以控制肿瘤生长的一个可能解释是，简单地消除抑制可能不能恢复对肿瘤的足够免疫，而需要额外的T细胞因子来维持抗肿瘤免疫。

因此作者评估了Pro-IL-12治疗是否可以改善ICB功能。理论上IL-12可诱导IFN增加肿瘤组织PD-L1，负向调节T细胞功能。实验也发现IL-12前药处理后肿瘤组织中PD-L1的表达都有上调。

为了确定Pro-IL-12是否能防止抗PD-L1治疗后的肿瘤复发，作者做了体内联合用药的使用，发现联合用药效果很好（图E和F），综上所述，这些数据揭示了Pro-IL-12在临床上联合抗PD-L1治疗晚期肿瘤的治疗潜力。

九 人类Pro-IL-12前体表现出与小鼠Pro-IL-12前体相同的特征

小鼠IL-12在结构上与人类IL-12相似，但两个分子并不完全相同。为了确定作者的Pro-IL-12设计是否可用于人类，作者又设计了人源化的Pro-IL-12去验证结果。

从图A和B的结果看，人源化后区别不大。IL-12诱导了高水平的IFNγ产生， CD8+ PBMCs单独产生的IFN水平远高于CD4+ PBMCs单独产生的IFN水平，人源化的 Hu-Pro-IL-12的活性比rhIL-12和hu- ht - il -12低约四倍，与重组MMP14孵育后活性完全恢复。

但是有一点不同，IL-12受体复合体由两种类型的细胞因子受体亚基组成，作者发现R1/R2-hu-Pro-IL-12（两个亚基一起遮蔽IL-12）在重组MMP14孵育后，其活性仍被拯救(图C)。这一点在鼠源中不一样，鼠源药物设计使用R1/R2遮蔽IL-12受体以后会降低活性，同时体内实验结果比单用R1遮蔽差很多。所以人源化的后续研究中选用了R1/R2-hu-Pro-IL-12。

最后通过人源化小鼠模型，验证发现IL-12-Fc和前药处理组的肿瘤大小显著减小，提示抗肿瘤免疫激活(图D)。体重上，前药物治疗组IL-12- Fc组在给药后10天内恢复正常，而IL-12- Fc组在整个实验过程中保持低体重。总之，人Pro-IL-12表现出与小鼠Pro-IL-12相似的阻断/恢复特性，从相同类型的细胞诱导IFNγ，并成功介导了肿瘤排斥反应，进一步支持了作者的设计的临床可行性。

总结

在不引起严重毒性的情况下，有效地激活预先存在的肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)是一个挑战。白细胞介素-12 (IL-12)可有效激活淋巴细胞，但其半衰期短，且具有剂量相关性毒性，限制了其临床应用。在本研究中，作者开发了一种肿瘤条件IL-12 (Pro-IL-12)，它用IL-12受体的选择性细胞外受体结合域掩盖了IL-12，并在被肿瘤表达的基质金属蛋白酶暴露后优先持续激活TILs。与IL-12-Fc相比，IL-12的全身注射显示毒性降低，但对肿瘤的控制更好。在机制上，IL-12诱导的抗肿瘤反应依赖于TILs和IFNγ。此外，IL-12与IL-12R直接结合在CD8+T细胞上对于发挥最大治疗作用至关重要（不是CD4+T细胞）。当联合使用时，Pro-IL-12提高了免疫检查点封锁和靶向治疗的疗效。因此，作者的研究表明，Pro-IL-12可以使TILs恢复活力，与当前的治疗方式相结合，可以有更好的疗效。

思考：

一 本次设计的创新点在哪里？

1 使用内源性的IL-12受体遮蔽IL-12, 既能降低IL-12的活性又不引入潜在的免疫原性位点。

2 通过使用MMP-14可切割的氨基酸序列底物作为Llinker，由于肿瘤组织高表达的MMP-14，实现其在肿瘤中再发生IL-12暴露的设计，降低了不良反应。

二 MMP系列的酶那么多，为什么选择MMP-14?

MMP14是一种膜结合的MMP，在肿瘤细胞和炎症细胞上表达，在TME内大量富集，向TME外泄漏最少(1,2)。MMP14在大多数人类实体瘤中显著富集，但在邻近的正常组织中没有。选择MMP14识别的SGRSENIRTA氨基酸序列底物作为可切割底物连接子。对于MMP水解效率，MMP14为79%，而MMP2为4%，MMP9为9%(3)。因此，SGRSENIRTA基质具有高度的MMP14特异性。

三 本次研究中所用的Fc段从始至终一直是用的人源化的？早期小鼠实验不怕引起免疫原性影响实验结果吗？

早些年的嵌合抗体是用鼠源的可变区，其他都是人源的，说是为了降低人体内的免疫原性，实际上还是有免疫原性。现在情况颠倒过来了，早期研究中IL12是鼠源的，Fc却是人源的，对老鼠的应该也会有免疫原性，这个不会影响实验结果么。可能是作者觉得影响不是很大，没有必要再去做一个鼠源的Fc？有懂的朋友可以留言。

四 Linker设计中G4S是什么？为什么选择它？

G4S是蛋白融合常用的linker之一，一般为15个氨基酸，通常选用甘氨酸（Gly，G）和丝氨酸（Ser，S）构成一段具有一定弹性及蛋白酶抗性的多肽Linker，序列为（GGGGSGGGGSGGGGS），简写为（G4S）3，这样的序列不会导致一些特异性的二级结构形成。研究表明，调整Linker序列(GGGGS)3的核苷酸组成，能使重组融合蛋白的mRNA水平显著增加30倍，转染效率更高。

五 小鼠肿瘤模型用ProIL-12以后，体重为什么会增加？

（作者文中是说未改变，实际上是有明显的先增加后减少），对照药Hetero-IL-12中小鼠体重为什么会减少？

肿瘤模型体重减少是正常情况，先增加后减少是为什么我也没有想清楚，有想法的朋友可以给我留言。

七 对本篇文章有什么意见？

1 从第三个部分A图来看，在药物注射以后，肝脾肾肺心等都有不同程度的IL-12分布，实在让人不得不担心细胞因子风暴或肝脏或其他器官组织损伤情况，后续想做转化，猴子的药代动力学和毒理学实验一定要的仔细认真。 

2  小鼠中的实验如果IL-12用鼠源的，Fc段应该也用鼠源的最好，避免免疫排斥干扰实验结果。

参考文献：

1. S. P. Turunen, O. Tatti-Bugaeva, K. Lehti, Membrane-type matrix metalloproteases as diverse effectors of cancer progression. Biochim. Biophys. Acta 1864, 1974–1988 (2017).

2. P. McGowan, M. Duffy, Matrix metalloproteinase expression and outcome in patients with breast cancer: Analysis of a published database. Ann. Oncol. 19, 1566–1572 (2008).

3. S. J. Kridel, H. Sawai, B. I. Ratnikov, E. I. Chen, W. Li, A. Godzik, A. Y. Strongin, J. W. Smith,A unique substrate binding mode discriminates membrane type-1 matrix metalloproteinase from other matrix metalloproteinases. J. Biol. Chem. 277, 23788–23793 2002

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