世界首个circRNA疗法公司 Orna 公布最新研发进展

撰文｜滴水

编辑｜豆腐

来源 | BioFactory

2018年，麻省理工学院 （MIT） 的 Daneil Aderson 等人在 Nature Communications 期刊发表论文， 成功利用具有剪切活性的 I 型内含子构建 circRNA 用来表达外源蛋白，并且申请到构建 circRNA 的专利。

在2021年2月，Orna Therapeutics 完成首轮融资，Daneil Aderson 为其联合创始人。这也是全球首家利用 circRNA 开发新疗法的公司。

Orna Therapeutics  在其官网上 表示，将线性 mRNA 的想法抛之脑后，创造完全工程化的环形RNA——oRNA，作为一种全新的 RNA 药物，可以充分发挥 RNA 的潜力，并有望改变我们治疗疾病的方式。oRNA 技术在癌症、再生医学、蛋白质替代、传染病和自身免疫疾病等多个领域具有广泛应用潜力。将 oRNA 与新型递送技术结合，有望开创 RNA 治疗的下一个突破。

2022年5月16日，在美国细胞基因治疗行业会议（ASGCT）上，Orna Therapeutics 分享了一系列最新研发和工艺生产进展。

比较环形RNA和线性RNA特征

包封

测试不同的可电离脂质，不同长度 oRNA，在包封过程中，均能取得类似的低 PDI （<0.1） 和非常好的包封效率 （90%） 。与对应的线性 mRNA-LNP 相比，oRNA-LNP 粒径更小。

体内分布

利用 luciferase 荧光素酶作为报告基因，比较 oRNA-LNP 和 mRNA-LNP （来源于Trilink） 在小鼠体内不同组织中的表达差异。在测试的4组 LNP 配方中，相同 LNP 配方的同组内，oRNA-LNP 在脾脏中的表达量是比较高的，而对应的 mRNA-LNP 在脾脏中几乎不表达。

在肝脏中，相同 LNP 配方的同组内，oRNA-LNP 普遍不如 mRNA-LNP 表达水平高。对于 oRNA-LNP，其在脾脏和肝脏中表达比例的差异取决于 LNP 配方。脾脏是非常重要的免疫器官，含有很多免疫效应细胞，例如 T 细胞。oRNA 注射到体内，在脾脏中的表达显著高于线性 mRNA，这对于 mRNA 技术在 CAR-T 疗法的应用来说有非常重要的意义。

脾脏T细胞内表达效率

在不同的 LNP 配方，不同的编码区，oRNA-LNP 在小鼠脾脏 T 细胞中的表达均显著优于线性 mRNA。

oRNA-LNP 在人 T 细胞中的表达随着 oRNA 含量的增加而增加，呈现出剂量依赖效应。

circRNA应用于蛋白替代疗法

杜氏肌营养不良症 （DMD） ，是由于 X 染色体上编码抗肌萎缩蛋白的基因（Dystrophin）突变所导致的遗传病，患者无法产生足够的抗肌萎缩蛋白，因此肌肉组织逐渐被脂肪和纤维化组织取代。抗肌萎缩蛋白基因 （Dystrophin） 非常大，编码区全长达11kb，蛋白分子量达 427kDa，使得传统蛋白替代疗法难以实现。

一种可行的治疗方法是使用截短的抗肌萎缩蛋白进行治疗，辉瑞公司、Solid Biosciences 就正在使用 AAV 病毒递送截短的肌萎缩蛋白基因来治疗 DMD。但这类基因疗法存在着病毒载体免疫原性和克隆能力低下的限制。

Orna Therapeutics 公司则使用 oRNA-LNP 进行 DMD 的治疗，可以实现持久高效的蛋白表达，甚至是长编码区蛋白的表达，以及多次给药。编码全长抗肌萎缩蛋白和截短体的 oRNA 均能在原代骨骼肌细胞中表达。

通过肌肉注射的方式，将微型 Dystrophin oRNA-LNP 打到 MDX 小鼠模型中 （DMD 基因突变，缺失抗肌萎缩蛋白） ，在四头肌中的表达量可以达到野生型小鼠表达全长抗肌萎缩蛋白量的4.2%，并且正确定位到肌膜上 （sarcolemma） 。

IRES序列筛选

oRNA 与线性 mRNA 相比，没有游离的末端，无须帽子和尾巴结构，无须修饰核苷酸。蛋白表达量和表达持续时间均显著优于线性 mRNA。oRNA 起始蛋白翻译，是通过 IRES 序列介导的。IRES 是一段较长的序列>500nt，其复杂的二级和三级结构对于起始蛋白翻译的活性非常重要。

IRES分类

IRES 来源病毒 UTR 序列，可以分为源自细胞质环境的 IRES 和源自细胞核环境的 IRES。源自细胞质环境的 IRES 起始蛋白翻译，需要细胞质中的 ITAFs，不需要特殊的化学修饰，长度在400nt-1000nt+。源自细胞核环境的IRES起始蛋白翻译，必须在细胞核中经过一定程度的化学修饰，与核内特殊的蛋白相互作用，具有更短的序列<200nt。源自细胞核环境的 IRES 不能用于启动细胞质环境中 RNA 的翻译。

影响IRES翻译活性的因素

IRES 活性和长度之间存在相关性。400-800nt IRES 活性是最高的。IRES 活性依赖于细胞类型，在不同的细胞类型中具有不同的表达活性。

IRES 在肌管细胞 （myotube） 和肝细胞中的翻译活性具有相关性，而 T 细胞中 IRES 的活性与这两种细胞中的 IRES 活性具有相关性。只有极少数的 IRES 在所有细胞类型中均展现出非常强的翻译活性。

筛选IRES遇到的困难

研发人员已经筛选到上百个具有非常高活性的 IRES 序列，有一些翻译活性要比常用的 EMCV-IRES 高出10-40倍。他们还发现来自类似病毒的 IRES 在翻译活性有着非常显著的差异。

总结

在 Orna Therapeutics 分享的报告中，我们可以看到他们在工艺优化方面做出一系列的摸索，测试不同 LNP 配方包封不同长度的环形RNA，测定 oRNA-LNP 在体内不同器官的分布以及表达情况。更加重要的是，他们对 IRES 序列进行高通量筛选，研究影响 IRES 表达活性的因素，摸索不同细胞背景下 IRES 表达活性。

Orna Therapeutics 目前公布了4个研发管线，分别是 CAR-T 细胞治疗、DMD 疗法、新冠疫苗，以及1款未公开信息的管线。