科研 | NAT MICROBIOL（IF:17.7）：结肠炎小鼠模型中鉴定与疾病变异相关的肠道微生物种类

编译：微科盟小木，编辑：微科盟小编、江舜尧。

微科盟原创微文

导读  

实验小鼠模型是基础生物医学研究的核心；然而，遗传相同的小鼠和小鼠设施之间存在变异性，因此难以进行比较。特定的肠道细菌是否会驱动人类疾病小鼠模型中的免疫表型变异仍然知之甚少。我们使用来自单一动物设施的579只遗传相同的实验室小鼠进行大规模实验，旨在确定广泛使用的硫酸葡聚糖钠(DSS)炎症性肠病小鼠模型中疾病变异的原因。常用的治疗终点指标(体重减轻和肠道病理)显示出有限的相关性，并且在小鼠谱系中存在差异。通过分析肠道微生物群并结合机器学习和靶向厌氧培养，鉴定和分离了两种以前未描述过的物种，即Duncaniella muricolitica和Alistipes kanasuensis，并证明它们在DSS小鼠模型中发挥主导作用，导致可变的治疗终点指标。本研究表明，已确定的肠道微生物物种在世界各地的小鼠设施中很常见，但并非普遍存在，并建议研究人员监测这些物种，以便为改善人类肠道疾病小鼠模型提供实验设计机会。

论文ID

原名：Identification of gut microbial species linked with disease variability in a widely used mouse model of colitis

译名：在广泛使用的结肠炎小鼠模型中鉴定与疾病变异相关的肠道微生物种类

期刊：Nature Microbiology

IF：17.745

发表时间：2022.4

通讯作者：Trevor D. Lawley

通讯作者单位：英国威康桑格研究所

DOI号：10.1038/s41564-022-01094-z

实验设计

结果

1疾病严重程度在DSS小鼠模型中是高度可变的

我们通过饮用水向来自14个不同亲本谱系的579只SPF野生型C57BL/6N小鼠(雄性297只，雌性282只；中位年龄11周；标准差12天)给药1.5% DSS持续7天。在DSS处理10天后，我们在这些遗传完全相同的小鼠的实验终点上观察到广泛的变异，并对中端和远端结肠的肠道病理进行了组织学评估，从严重的炎症(以广泛的隐窝丢失、白细胞浸润和水肿为特征)到无明显炎症(图1a、b)。在DSS处理小鼠的体重变化中也观察到了显著变化，整个队列的反应范围从12%的体重增加到30%的体重减轻(图1c)。鉴于组织学评分和体重减轻的回归分析显示相关性有限(R2 = 0.27)，表明体重减轻和肠道病理学结果(DSS模型中常见的实验终点)可能是对DSS的部分独立反应(图1d)。这种关系与导致DSS模型中实验终点的系统并发症一致。

图1 疾病严重程度在DSS小鼠模型中是高度可变的。a，野生型C57/BL6小鼠DSS处理后结肠中远端炎症反应的代表性图像，得分0分(上)，12分(下)。b-c,暴露于DSS处理的579只野生型C57BL/6N小鼠(雄性297，雌性282；中位年龄11周；标准差12天)的平均组织学评分(b)和体重变化(c)分布。d，所有579只小鼠的体重变化和组织学评分之间的关系。R2 = 0.273。

2 肠道菌群是DSS反应变化的主要驱动因素

为了确定决定疾病结果的主要因素，我们建立了一个包含小鼠性别、年龄、谱系、父母、小鼠房间和实验日期的随机森林分类模型，以评估每个因素的相对重要性(扩展数据图1)。在相同设施的标准SPF条件下，这些遗传相同的C57BL/6N小鼠中，相关分析证实了体重减轻和组织学评分的最强预测因子是亲代谱系(P<0.01，Kruskal-Wallis，扩展数据图1)。

由于所有小鼠都来自于相同的遗传初始种群，因此其DSS表型最有可能的介质是外在谱系特异性因素。然而，为了排除宿主遗传或菌落之间的表观遗传差异的作用，并确定微生物群是否单独导致观察到的表型变异，从代表极端疾病结果的SPF小鼠(未接受DSS处理)中收集粪便样本，并用于定殖C57BL/6N无菌小鼠。然后对这些定殖的受体小鼠进行DSS处理，包括每日体重测量，在DSS处理开始后10天收集结肠切片并进行组织学分析。受体小鼠的体重减轻和病理学评分与在各自供体小鼠谱系中观察到的结果没有统计学差异，但在疾病谱系和非相关谱系之间存在显著差异(P=0.0002，配对t检验；图2a)。从这些结果可以清楚地看出，独立于宿主遗传或表观遗传谱系特异性因素等其他因素，微生物群足以产生观察到的对DSS给药的表型反应的变化。

图2 与DSS疾病变异相关的候选细菌分类群的发现。a，常规SPF小鼠(谱系A、B、C、D，纯色)和无菌小鼠(谱系A、B、C、D，阴影颜色)在DSS攻毒10天后体重变化的比较(P = 0.0002，双尾t检验，Welch’s校正；数据以平均值±标准差表示，n = 4(谱系A、C、C+GF、D和D+GF)和n = 3(谱系B、B+GF、A+GF))。b，在DSS处理前后的样本中，表现出无症状或>5%体重减轻和炎症的样本中拟杆菌门(红色)，厚壁菌门(绿色)和变形菌门(蓝色)的分布。c,16S rRNA扩增子测序分析的主成分分析表明，DSS处理前样本(蓝色)和DSS处理后样本(红色)之间存在明显的差异，无论谱系如何。d，Alpha多样性采用按DSS处理前后样本分组的Shannon多样性指数(*P = 0.0357，配对t检验；n = 77)。e，DSS攻毒前(蓝色；Spearman相关性，0.196)和DSS攻毒后(红色；Spearman相关性，-0.289)的体重变化与变形菌相对丰度的关系。f，在体重减轻> 5%(红色)和体重没有下降(黑色)的小鼠样本中，DSS攻毒前，A. faecis、A. Okayasuensis、D. muricolitica和S. muris的相对丰度(P = 0.0264、0.0006、0.0351、0.0010，双尾t检验；分别为n = 18和n = 13只独立小鼠)。*P <0.05；***P≤0.001)。

3 驱动疾病变异的细菌的发现

确定了微生物群在遗传相同小鼠DSS表型结果介导中的重要性之后，我们接下来试图了解单个设施中小鼠微生物群的变异程度，并定义DSS处理中发生的微生物群变化。收集DSS处理前和DSS处理后10天的粪便样本，并采用16S rRNA扩增子测序进行分类分析，以确定微生物群落组成。与先前关于胃肠道炎症的报道一致，本分析显示DSS处理前后样本之间的微生物群落明显分离(图2b,c和扩展数据图2,3)以及细菌多样性显著降低(Shannon多样性指数，P = 0.0357;图2d)。虽然变形菌的增加通常与肠道微生物群失调有关，而在DSS处理后观察到变形菌的增加(P <0.05，Kolmogorov-Smirnov检验)，在DSS处理前(图2e；Spearman相关性，0.196)或处理后(图2e；Spearman相关性，-0.289)观察到体重减轻和变形菌比例之间存在有限的关联。这表明其他肠道细菌可能是导致DSS抗性和易感性变化的原因。

鉴于我们在无菌小鼠实验中观察到的疾病表型的传播性，我们推断所观察到的表型变异主要依赖于DSS处理前的基线微生物群组成。为了了解与疾病结果风险增加相关的微生物群组成，我们对暴露于DSS前后的肠道微生物群组成进行了线性判别分析。这种无监督分析利用小鼠谱系特异性细菌之间的变异性来识别最能预测DSS反应的细菌分类群。使用这种方法确定了2种与无疾病相关的统计学上不同的细菌分类群，以及与>5%体重减轻相关的5种统计学上不同的细菌分类群。值得注意的是，在暴露于DSS前，这些分离株在小鼠体内的发生和丰度之间没有任何关联，并且在暴露于DSS后的小鼠微生物群中没有发现等效的预测细菌分类群。我们的结果表明，在DSS暴露之前，特定肠道细菌类群的存在可能会影响疾病的严重程度和结果，其可能是通过引发或预防疾病。

4 用于功能验证的细菌物种分离

虽然我们通过16S rRNA基因测序显示了特定细菌分类群与DSS介导的疾病结果之间的明确关联，但对菌株水平的准确分类鉴定和实验验证需要对细菌菌株的纯培养物进行分离和基因组测序。为了靶向和纯化菌株，我们接下来对小鼠粪便样本中的约2000个细菌菌落进行了培养。所得分离株经毛细管16S rRNA基因测序鉴定，包括4个先前鉴定的细菌分类群，2个与疾病相关，2个与健康相关。对这些分离株进行全基因组测序和基因组分析，以帮助进行精确的分类和系统发育分配(扩展数据图4)。此外，我们对这4个物种进行了广泛的表型表征和比较基因组学分析(方法)，以作为初步命名健康相关细菌(Anaerostipes faecis和Sangeribacter muris)以及疾病相关细菌(Duncaniella muricolitica和Alistipes okayasuensis)的基础；值得注意的是，最后3个物种是小鼠特有的。在DSS处理前检查这些物种中的每一个物种的相对丰度，发现在体重未减轻的小鼠中，A. faecis(P = 0264，t检验)和S. muris(P = 0.0010，t检验)水平显著升高，在体重减轻> 5%的小鼠中，D. muricolitica (P = 0.0351，t检验)和A. okayasuensis (P = 0.0006，t检验)水平显著升高(图2f)。

接下来，我们在无菌小鼠或用这4种细菌菌株单殖4周的无菌小鼠中重复DSS实验模型(扩展数据图5和6)。在实验过程中，用DSS处理的对照无菌小鼠既没有减轻体重(图3a)，也没有经历死亡(图3b)，这表明肠道细菌的存在对于在我们的设施中引发明显的疾病很重要。在DSS处理的无菌小鼠中观察到类似的实验结果，无菌小鼠单殖两种健康相关细菌均未出现体重减轻或发生肠道病变(图3a)，也未出现显著的死亡率(图3b)。相比之下，当DSS处理的小鼠单殖两种疾病相关细菌时，观察到体重减轻更快、更明显(图3a)，存活率显著降低(图3b)。因此，我们确定并验证了D. muricolitica和A. okayasuensis作为小鼠细菌可以促进单殖共生细菌S. muri和A. faecis的小鼠中未观察到的疾病。

为了了解可能由疾病相关物种和健康相关物种引起的肠道炎症免疫反应，我们接下来检查了组织学、免疫细胞群和细胞因子的产生。在这些分析中，人类定植的A. faecis和设施中流行的D. muricolitica分别被选为典型的疾病和健康相关细菌。流式细胞仪分析从无菌小鼠中分离出的肠道固有层白细胞，结果显示，单殖A. faecis或D. muricolitica 4周后，两种菌株的定殖均未显著影响肠道白细胞和淋巴细胞亚群的组成(扩展数据图5b，c和6)。但DSS诱导的扰动和上皮破坏导致D. muricolitica单殖小鼠大肠固有层中的炎症性CD64+CD11c+单核/巨噬细胞显著增加，但在A. faecis单殖小鼠中则不然(扩展数据图5c,d和6)。这些单核细胞已被证明在幽门螺杆菌(Helicobacter)引起的炎症环境中发挥致病作用。这表明，虽然在稳态下既非致病性也非免疫原性，但在上皮损伤后，D. muricolitica可促进炎症反应的增加，而与健康相关的A. faecis则不会。重要的是，虽然DSS处理7天后，D. muricolitica单殖小鼠的结肠和盲肠组织学样本偶尔表现出严重炎症的特征，但这与A. faecis单殖小鼠的组织学样本没有统计学差异(图3c,d)，且与观察到的体重减轻不一致。这再次表明，DSS模型中的体重减轻可能并不总是与肠道炎症和病理相关。

为了确定D. muricolitica或A. faecis的存在是否与体重变化呈正相关或负相关，我们接下来检测了20只独立的小鼠，并使用定量PCR(qPCR)评估DSS处理前的细菌水平与第10天观察到的体重变化之间的关系。该分析发现，体重变化与DSS处理前A. faecis丰度呈正相关(R = 0.3679, P =0.0046;图3e)。同样，体重变化与D. muricolitica丰度呈负相关(R2 =0.3626, P = 0.0050;图3e)。这一独立确认进一步证实了这些物种与DSS结肠炎严重程度之间的关系，但还需要额外的研究来确认它们作为病原体的作用。

图3 用候选细菌分类群单殖小鼠的表型分析。a,b用A. okayasuensis(红色；n = 14只动物，P = 0.00001)、A. faecis(绿色；n = 10只动物，P = 0.31731)、D. muricolitica(紫色；n = 10只动物，P = 0.00074)或S. muris (蓝色；n = 11只动物，P = 0.16653)预定殖的无菌小鼠和无菌对照中响应口服DSS攻毒的平均体重减轻/增加(a)和存活率(b)。通过log-rank (Mantel-Cox)检验将所有生存曲线与PBS对照进行比较，并绘制中位和四分位范围。c,d来自两个实验的代表性结肠图像(400×)，每组有3-7只小鼠(c)，以及来自对照无菌小鼠(PBS)或用A. faecis(Af, n = 12)或D. muricolitica(Df, n = 14)单殖并DSS攻毒7天的小鼠的中结肠(P = 0.4939，Mann-Whitney检验) (d)和盲肠(P = 0.1972，Mann-Whitney检验)的H&E染色组织学评分。在每组第一只小鼠达到基线体重的80%后，审查平均体重减轻曲线。e, 20只小鼠的第10天体重减轻相对于第0天的起始体重，显示出体重变化与A. faecis流行率呈正相关(R2 = 0.3679，P = 0.0046)(绿线)，而体重变化与D. muricolitica流行率则呈负相关(R2 = 0.3626，P = 0.005)(紫线)。黑色实线表示95%置信区间。*P≤0.05，**P≤0.01，***P≤0.001，****P≤0.0001。

5 其他小鼠设施的全球分布和流行

因为D. muricolitica和A. okayasuensis影响了我们小鼠设施中DSS结肠炎的结果，我们接下来探索了这些细菌在世界其他小鼠设施中的存在和分布。为此，我们首先收集了582个来自对照SPF小鼠的公开可用的鸟枪法宏基因组样本，生成了全球代表性实验室小鼠肠道微生物组。我们将这个数据集与威康桑格研究所40只小鼠粪便的鸟枪法宏基因组数据相结合，生成了一个涵盖12个国家31个研究所的全球小鼠肠道微生物组数据集。然后，我们确定了该小鼠微生物组数据集中健康相关细菌S. muris和A. faecis以及疾病相关细菌D. muricolitica和A. okayasuensis的流行率和丰度。

D. muricolitica和A. okayasuensis都是小鼠微生物群落的优势成员，分别存在于54.5%和47.9%的样本中，其在每个样本的平均丰度分别为0.52%和0.48%。重要的是，在80.6%(25/31)的分析机构中分别检测到D. muricolitica和A. Okayasuensis(图4)，并且只有三个机构不包含这些物种中的任何一个。相比之下，在与健康相关的物种中，S. muris在小鼠肠道微生物群中占优势，存在于96.5%的样本中，平均丰度为6.2%，而A. faecis是一个相对较低的物种，存在于5.9%的样本中，平均丰度为0.22%。所有研究机构(31/31)均检出S. muris，而A. faecis的检出率为25.8%(8/31)。每个物种的丰度在各研究所之间也存在差异(图4)。因此，我们证明从我们研究所培养的小鼠衍生细菌是常见的小鼠共生体，重要的是，D. muricolitica和A. okayasuensis在世界各地的动物设施中很常见，但并不普遍。

图4 疾病和健康相关物种的全球流行病学和机构内变异。a-c，国际小鼠设施中SPF小鼠中疾病和健康相关物种的流行率和丰度。a，D. muricolitica(紫色)、A. Okayasuensis(红色)、A. faecis(绿色)和S. muris(蓝色)的机构内流行率。如果将≥0.01%的鸟枪法宏基因组序列分配给该物种，则该物种被定义为存在于样本中。机构内流行率是按每个机构中存在物种的样本百分比计算的。b，条形图显示每个研究所的样本数量。c，机构中各物种的平均丰度热图。在b和c中，研究所名称与a中的名称相对应。对于平均丰度，数据是分配给每个物种的分类reads的百分比，使用贝叶斯乘法替换去除零计数，然后进行中心对数比转换。

讨论

尽管DSS小鼠模型的实验可变性限制了数据的解释和翻译，但该模型越来越多地用于基础研究(PubMed上发表了>6000篇DSS模型文章)以及制药和生物技术行业。使用共居、杂合交配和其他实验程序使实验中的微生物群标准化，并确保直接测量小鼠遗传背景对疾病表型的影响，而不是间接和未知的微生物群相关影响。在本研究中，我们利用DSS结果的可变性，并结合微生物组分析、机器学习、厌氧培养和无菌小鼠验证实验，以获得对DSS疾病微生物群决定因素的相关生物学见解。虽然对微生物组的这种考虑并没有完全消除DSS模型中多维性的影响，但我们确定并进行了D. muricolitica和A. okayasuensis的实验验证，这两者都对DSS结果有显著影响。

有趣的是，D. muricolitica和A. okayasuensis在系统发育上截然不同，且在它们的基因组中都没有计算预测的毒力因子。虽然尚不清楚这些分离物如何导致DSS疾病，但两者都显示出利用多糖的潜力，这可能通过与黏液层的相互作用来介导这种关系。我们还注意到，体重减轻和肠道病理并不总是相关，因此它们不应该被用作彼此的替代物。同样，即使在没有严重炎症的情况下，单殖小鼠的体重也明显减轻，这表明仅激活关键途径就能对实验结果产生重大影响。总之，这些见解提出了对宿主相互作用和这些重要的小鼠特异性细菌的生物学进行进一步实验研究的需要。

我们建议研究人员应该考虑在他们的小鼠设施中监测D. muricolitica和A. okayasuensis，就像对其他影响免疫表型的微生物(如分节丝状菌)进行监测一样。在某些情况下，如果设施中不存在这些细菌，对动物进行预定殖可能会产生更好的实验控制，并增加对这种重要且广泛使用的人类疾病小鼠模型的信心。总体而言，本研究表明，除了描述的遗传和疾病表型外，应用宏基因组学技术报告微生物群组成应该是DSS小鼠模型的最低标准要求。我们已将D. muricitis、A. Okayasuensis、S. muris和A. faecis菌株和基因组上传到公共存储库中以支持本项研究。 

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41564-022-01094-z