【行研】mRNA疫苗递送系统盘点：基石与瓶颈

人类和疾病的抗争由来已久，很长一段时间内都是以人类的惨败收场。随着疫苗的普及，那些关于天花、小儿麻痹症、白喉、麻疹等的痛苦记忆离我们越来越远。疫苗的出现无疑是医学史上浓墨重彩的一笔。

作为领跑此次新冠疫苗研发的技术之一，mRNA疫苗是第三代疫苗，具有成本低、生产效率高、安全性高的优势，对于传统疫苗无力应对的新型传染性病毒有巨大应用潜力。mRNA疫苗通过传递编码病毒抗原的mRNA，在体内表达抗原，激发机体免疫应答，发挥预防或治疗疾病的作用。在SARS-CoV-2基因组测序公布后45天，就有相应的mRNA疫苗进入到临床研究，到2020年12月11日，FDA批准辉瑞&BioNTech的新冠疫苗用于16岁及以上人群预防新冠的紧急授权（EUA）。

mRNA可以满足基因治疗、癌症治疗以及疫苗等需求，是一种非常有潜力的候选药物。

尽管mRNA疫苗应用前景较为广阔，但其发展面临着两个主要的障碍：

（1）mRNA不稳定，容易被细胞外核酸内切酶降解；

（2）mRNA具有高天然免疫原性，体内传递效率低下，难以高效率的发挥其作用。要实现mRNA疫苗的广泛应用，需重点解决递送技术。

一般来说，mRNA疫苗的制备过程包括合成、修饰和递送。其中，mRNA的递送难度最高，是差异性的集中体现。对于mRNA疫苗，递送系统有三大职责：一是有效包裹和保护mRNA在到达靶点前维持稳定；二是帮助 mRNA有效成分进入细胞；三是在mRNA到达溶酶体前将其释放进入细胞质中。

目前有两大类用于递送mRNA疫苗的基本方法。一类是在体外将mRNA转染到树突状细胞（DCs）中，然后再将转染的树突状细胞输入体内。另一类是在有或没有载体的情况下直接注射mRNA。前者能够精确控制细胞靶标、转染效率等条件，但这是一种昂贵且劳动密集型疫苗接种方法。而后者直接注射mRNA的方法更快速且更具经济效益。

mRNA疫苗的常用递送方法和载体包括：a.裸mRNA、b.电穿孔、c.鱼精蛋白、d.阳离子纳米乳液、e.修饰的树枝状纳米颗粒、f.鱼精蛋白脂质体、g.阳离子聚合物、h.阳离子聚合物脂质体、i.多糖颗粒、j.阳离子脂质纳米颗粒、k.阳离子脂质胆固醇纳米颗粒、l.阳离子脂质胆固醇PEG纳米颗粒。

图1.mRNA疫苗的主要递送方式

资料来源：Nature Reviews Drug Discovery

1.体外转染树突状细胞（DCs）：树突状细胞是免疫系统中最有效的抗原呈递细胞，能够引起适应性免疫反应，还可能会将完整的抗原呈递给B细胞以引发抗体反应。而且树突状细胞也非常适合mRNA转染。基于这些原因，树突状细胞成为体内和体外mRNA疫苗转染的有吸引力的目标。

尽管裸mRNA可以通过内吞作用进入树突状细胞，但电穿孔技术能够提高转染效率。电穿孔的mRNA递送方法因其无需载体分子即可产生高转染效率的能力而受到青睐。然后将已转染mRNA的树突状细胞重新输入体内以启动免疫反应。大多数体外转染mRNA的树突状细胞疫苗主要引起细胞介导的免疫反应，因此它们主要用于治疗癌症。

2.体内注射裸mRNA：裸mRNA已成功用于体内免疫，特别是在优先靶向抗原呈递细胞的形式中，如皮内和结内注射。有研究表明，使用编码肿瘤相关新抗原的裸露、未修饰的mRNA进行重复结内免疫注射可产生强大的T细胞反应并增加无进展生存期。

3.体内物理递送：为了提高体内mRNA摄取的效率，有研究使用物理方法来穿透细胞膜。例如使用基因枪的方法，将金纳米颗粒与mRNA复合后进行注射。近年来，该领域更倾向于使用脂质纳米颗粒或聚合物纳米颗粒进行递送。

4.基于阳离子脂质和聚合物的递送：在过去几年中，阳离子脂质和聚合物已成为广泛使用的mRNA递送工具。这受益于对小干扰RNA（siRNA）体内递送的研究。

（1）脂质体（Liposomes）是由单层或多层磷脂双分子组成的球形囊泡，囊泡内为含有靶基因的水性核心。通常使用含有极性头部基团和非极性尾部的材料制备，这些基团之间的疏水和亲水相互作用刺激囊泡形成。1978年，科学家们首次使用脂质体成功将编码兔球蛋白的mRNA递送至淋巴细胞。之后陆续出现了不同种类的脂质体作为mRNA递送载体；

（2）脂质纳米颗粒（LNP）是最为成熟也是最为主流的递送系统。LNP由被脂质双层壳包围的水性核心组成，脂质双层壳由不同的脂质组成，每种脂质都发挥着不同的功能。LNP设计的核心为可离子化脂质选取及确认各组分比例，企业多在此方面进行专利布局，形成专利壁垒。LNP表面可用特定的靶向序列进行修饰，从而更好地将mRNA递送到靶组织，引起免疫反应。目前三大mRNA疫苗巨头企业，Moderna、CureVac和BioNTech均采用了LNP递送技术；

图2.脂质纳米颗粒的主要脂质成分

资料来源：Nature Reviews Drug Discovery

（3）脂质-聚合物杂化纳米粒（lipid-polymer hybrid nanoparticles，LPNs）是包含聚合物内芯和脂质壳的纳米粒子结构，在物理稳定性和生物相容性方面具有聚合物纳米粒子和脂质纳米粒的互补特性。研究证明，无论在体内还是体外，脂质-聚合物杂化纳米粒都能有效的递送siRNA；

（4）脂联聚乙二醇（PEG）可延长制剂的半衰期，胆固醇作为稳定剂，和天然存在的磷脂，能共同支撑脂质双层结构。

（5）脂多糖（Lipopolyplex，LPP）纳米递送平台是一种以聚合物包载mRNA为内核、磷脂包裹为外壳的双层结构，LPP的双层纳米粒具有更好的包载功能，并能够随聚合物的降解逐步释放mRNA分子。

（6）基于角鲨烯（squalene）的阳离子纳米乳液也被用于递送mRNA。这些纳米乳液由一个基于角鲨烯的核心和一个脂质外壳构成，mRNA被吸附在纳米乳液的表面。有些角鲨烯的配方可以起到佐剂的作用，例如诺华的MF59在FDA批准的流感疫苗中作为佐剂。MF59导致注射部位的细胞分泌趋化因子，募集抗原呈递细胞，促进单核细胞分化为树突状细胞，并且增强抗原呈递细胞的抗原摄取。

5.其它递送系统

在基于脂质和聚合物的递送方式之外，多肽也可以被用于递送mRNA，因为有些氨基酸携带阳离子或双亲性氨基基团，可以与mRNA结合。

类病毒体（virus-like particle, VLP）递送系统是利用mRNA茎环结构与噬菌体衣壳蛋白特异识别的原理，通过病毒工程技术，将病毒和mRNA两者的优点完美的结合起来，创造了新型递送技术VLP-mRNA，其一方面借助了病毒的外壳，使得其感染细胞的效率特别高，另一方面，则基于mRNA自身瞬时性的特点，能让基因编辑治疗更加安全可控，其在递送CRISPR/Cas9的研究中表明，与长时间表达Cas9的病毒系统相比，通过VLP-mRNA递送Cas9 mRNA, Cas9的存在时间只有72小时，同时，可以显著降低、甚至完全避免脱靶效应。该递送系统由上海交通大学系统生物医学研究院蔡宇伽教授团队和复旦大学附属眼耳鼻喉科医院洪佳旭主任团队合作开发，是全球首创的基因治疗递送载体技术。

SEND递送系统是基于 RNA 基因疗法的有效递送平台，可以重复给药，由华人科学家张锋教授研究团队开发。SEND 递送系统以人体内天然存在的 RNA 运输蛋白 PEG 10 为基础，通过对 PEG 10 蛋白进行改造就可以将不同的 RNA 运送到不同的细胞或器官。由于是天然存在于人体中的蛋白质，该平台相较于其他 RNA 递送方法可以有效避免机体的免疫攻击。由于 SEND 递送系统所用的 RNA 载体均来源于体内天然蛋白，这意味着这一系统不会触发机体免疫反应，副作用大大降低。未来，SEND 技术或将替代纳米脂质体和病毒载体，成为最适合基因编辑疗法的载体。

几十年前，科学家们就设想能够基于mRNA开发出安全、有效的核酸疫苗。如今这一愿望照进现实，使用LNP递送mRNA疫苗在预防新冠方面已取得成功。相信随着mRNA技术和递送技术的不断完善，这一创新治疗模式可以为癌症、罕见疾病、神经系统疾病等其它疾病类型提供更有效、持久的治疗选择。

参考文献：

[1] Thanki K, Zeng X, Foged C. Preparation, characterization, and in vitro evaluation of lipidoid polymer hybrid nanoparticles for siRNA delivery to the cytosol [J]. Methods in molecular biology. 2019, 1943, 141-152.

[2] Pardi N, Hogan M J, Porter F W, et al. mRNA vaccines —a new era in vaccinology [J]. Nature Reviews Drug Discovery. 2018, 17, 261-279.

[3] Chaudhary N, Weissman D, Whitehead K A. mRNA vaccines for infectious diseases: principles, delivery and clinical translation[J]. Nature Reviews Drug Discovery. 2021, 25, 1-22.

[4] Ling S, Yang S, Hu X, et al. Lentiviral delivery of co-packaged Cas9 mRNA and a Vegfa-targeting guide RNA prevents wet age-related macular degeneration in mice[J]. Nature Biomedical Engineering. 2021, 5, 144-156.

[5] Segel M, Lash B, Song J, et al. Mammalian retrovirus-like protein PEG10 packages its own mRNA and can be pseudotyped for mRNA delivery[J]. Science. 2021, 373, 882-889.