Dr.Ephys : 钠通道的画像

典型的钠通道广泛存在于神经、骨骼肌和心肌中，使可兴奋细胞产生和传导动作电位（AP，action potential），在神经信号的传递和心脏节律调节中发挥了重要的作用(Payandeh and Minor 2015)

电压门控钠离子通道的发现

1952年，诺贝尔奖获得者Hodgkin和Huxley教授首次在枪乌贼巨轴突上使用膜片钳技术记录到INa(Hodgkin and Huxley 1952)。经过一系列研究表明，哺乳动物钠通道是由一个成孔的α亚基和一个或多个非成孔的β亚基组成的贯穿脂质双分子层的大分子蛋白复合体。其中α亚基为功能性亚基，包括四个同源结构域（domains，DI-DIV），每个结构域含有六个跨膜片段（segments，S1-S6），能够独立行使钠离子选择、电压感受和失活功能(Goldin et al. 1986; Noda et al. 1986)。而β亚基由一个单跨膜螺旋连接胞外区免疫球蛋白样折叠的结构域组成，可以帮助调节电压依赖性的门控机制，也有越来越多的证据显示它们具有在特定位置固定钠通道的功能(Brackenbury and Isom 2011)。

钠通道结构示意图（Yu FH and Catterall WA，2003）

电压门控钠离子通道的分类

通过电生理记录、生物化学纯化及分子克隆等技术，到目前已经确定了多种不同电压门控钠通道的类型。根据钠通道α亚单位基因分类，9种分别命名为Nav1.1-Nav1.9，由SCN(X)A基因编码。根据国际药理学家协会（International Union of Pharmacologists）对钠通道命名法的规定，以Nav1.1为例，Na表示该通道选择性通过的离子是Na+，下标V表示该通道是电压感应调控的通道，后面第一个数字代表该通道的基因亚家族（迄今已知的电压门控性钠通道只有1个亚家族），而小数点后的数字表示该通道的α亚基的亚型，按照被发现的顺序编码。脊椎动物中钠通道亚型从Nav1.1到Nav1.9编码，一般可以在名称最前面标注物种来源，如来源于人的hNav1.1。还有第十种钠通道蛋白Nax不是电压门控的，主要参与盐敏感。

若从药理学角度分类，可以将钠离子通道分为两大类：河豚毒素（tetrodotoxin，TTX）敏感型（TTX-S）和河豚毒素不敏感型（TTX-R）。人体中Nav1.1，Nav1.2，Nav1.3，Nav1.4，Nav1.6和Nav1.7属于河豚毒素敏感型。

哺乳动物电压门控钠通道α亚基的类型及特征(Ogata and Ohishi 2002)

构建了钠通道各亚型稳定表达细胞系，通过膜片钳电生理技术手段可用于钠通道靶点的药物筛选。

钠通道阻断剂分别作用于Nav1.1，Nav1.5和Nav1.8通道的典型电流图（爱思益普供图）

电压门控钠离子通道的功能研究

（1）钠通道的离子选择性

钠通道主要选择性地允许Na+通透，几乎不通过Ca2+，但对K+仍有很小的通透性，是Na+通透性的7%-10%，这也是在很正的膜电位时钠通道会有一过性外向电流的原因(Hille 2001)。随着分子生物学技术的发展和应用及其与电生理技术相结合，钠通道的氨基酸序列和对离子选择性通透的结构基础得以阐明，其序列和结构的改变与许多神经系统和心血管等离子通道病的发生发展密切相关。因而，作为可兴奋细胞的内源调控方式，钠通道已成为疼痛等神经功能性疾病诊疗的新药靶点。

（2）钠通道的电压门控性

经典的H-H模型（Hodgkin-Huxey model，H-H model）认为电压依赖性钠通道的状态由3个激活门和1个失活门所决定，在膜电位改变时这些带电门控位置发生改变，即具有电压依赖性。当细胞处于静息状态（-80mV左右）时，钠通道的激活门关闭而失活门开放，此状态下钠通道虽然关闭但能接受刺激而开放，称为静息态（resting state）。当去极化脉冲刺激（如0mV）作用于此状态的钠通道时，通道开放导致钠离子内流，此时钠通道激活门和失活门均开放处于激活状态（activated state）。激活的钠通道在持续的去极化刺激下很快失活。此时激活门开放而失活门关闭进入失活状态（inactivated state）。当膜电位发生复极化时，钠通道的构象得以恢复，此时激活门关闭而失活门开放，细胞又回到静息时的备用状态。所以，电压门控钠通道通透钠离子的门控机制是一个循环往复的过程。

电压门控离子通道的门控机制示意图(Hinard et al. 2016)

在此基础上，我们便可以运用膜片钳电生理技术对钠通道功能的分子基础和生物物理学特征有更好的理解。

（1）钠通道的电流-电压关系曲线

绘制电压门控钠通道的电流-电压关系曲线（I-V曲线）可以显示其基本电压依赖特性，如钠通道的激活电压范围和反转电位（Reversal potential，也叫翻转电位）等。钠通道对钠离子具有高度选择性，那么我们实测到的钠电流的反转电位就与理论算得的钠离子的平衡电位很接近，反推可以判断通道允许通透的离子的种类和单一性。利用连续阶跃电压刺激程序引发电压门控钠通道电流，以各个电压下的钠电流的最大值（即峰值）为纵坐标，以各刺激电压为横坐标，即可绘制成钠通道的I-V曲线。实际测试中，为了避免细胞膜电容对钠电流峰值大小的影响，I-V曲线以电流密度（pA/pF）为纵坐标。

电压门控钠通道电流的I-V曲线。（A）下方为电压刺激程序，维持电压为-120mV，给予去极化脉冲刺激以10mV的步阶从-80mV增至+80mV，引发出（A）上方所示的钠电流（图中简化表示，只显示了从-60mV~-20mV这5个测试电压及其相应电流线）。（B）为根据（A）中各电压下的钠电流峰值电流密度所绘制的钠通道的I-V曲线（爱思益普供图）

（2）钠通道的激活曲线

钠通道的激活过程是给予去极化刺激时钠通道快速开放导致钠离子电导快速增大的过程。利用上述刺激程序可以绘制出钠通道的稳态激活曲线（activation curve），通常以各电压下钠通道电导占最大电导的百分比为纵坐标，以各刺激电压（测试电压）为横坐标，绘制出激活曲线表示该通道的稳态激活程度和刺激电压间的关系。这里用标准化的电导（G/Gmax）评价通道的激活程度实际上代表了通道的开放频率，不管刺激电压还是测试电流是否为0，都不等于通道处于关闭状态。对电压依赖性离子通道来说，电导会随着电压的升高而相应快速增加至最大，此时通道开放频率处于饱和状态，再如何增加电压电导也不会改变。当然，在不能准确知道平衡电位或者在某些尾电流记录时因峰值处具有相同的电化学驱动力，激活曲线也可以采用相对尾电流峰值为纵坐标来作图，均符合Boltzmann分布。

电压门控钠通道电流的激活曲线。（A）下方为电压刺激程序，维持电压为-120mV，维持时间200ms后给予去极化脉冲刺激以10mV的步阶从-90mV增至+10mV，引发出（A）上方所示的钠电流。（B）为根据（A）中各电压下的相对电导所绘制的钠通道的G-V曲线（爱思益普供图）

（3）钠通道的失活曲线

利用双脉冲电压刺激程序诱发的钠电流可绘制钠通道的稳态失活曲线（inactivation curve）。首先给予按一定电压步阶的预脉冲（prepulse）或条件脉冲（conditioning pulse）刺激钠通道足够长时间以保证钠通道进入稳定的、不同程度的失活状态，然后给予第二个脉冲即测试脉冲（test pulse）（一般为可引起钠通道充分激活的去极化脉冲）检测除去在预脉冲刺激下已经失活的钠通道后剩余的尚能激活的钠通道电流，此电流越小，则说明预脉冲电压水平下进入稳定失活状态的通道所占比例越大。稳态失活曲线实际上反映了通道的失活或复活（二者互为消长关系）情况。激活曲线和失活曲线均可以通过计算半失活电压（V1/2，voltage for half-maximal potential）和斜率因子（κ，slope factor）来评价激活或失活快慢。

电压门控钠通道电流的失活曲线。（A）下方为双脉冲电压刺激程序，维持电压为-120mV，预脉冲电压以10mV的步阶从-120mV阶跃至-40mV给予一系列不同水平的长时程刺激，测试电压为-10mV，引发出（A）上方所示的钠电流（测试电压电流）。（B）为根据（A）中各电压下的相对电流所绘制的钠通道稳态失活曲线（爱思益普供图）

（4）钠通道的复活曲线

利用另一种形式的双脉冲电压刺激程序可用于研究钠通道的复活速率。两个相同的去极化脉冲（幅度足够大、时程足够长）刺激先后作用于细胞，改变两个脉冲之间的时间间隔，观察比较第二个脉冲刺激所引发的钠电流和第一个脉冲刺激所引发的钠电流的幅度。以两个脉冲刺激所引发的钠电流幅度的比值为纵坐标，以两个脉冲的间隔时间为横坐标，可以绘制出钠通道复活的速率曲线。利用单指数方程拟合该曲线可以得出钠通道的复活时间常数（Tau，time constant of recovery）。

电压门控钠通道电流的复活曲线。（A）下方为双脉冲电压刺激程序，维持电压为-120mV，预脉冲电压为-10mV，然后阶跃至-120mV持续不同时间使得钠电流得以恢复，再给予-10mV作为测试电压以检测恢复后的电流大小，引发出（A）上方所示的钠电流（恢复电流）。（B）为根据（A）中恢复时间内的相对电流（Itest/Ipre）所绘制的钠通道复活曲线（爱思益普供图）

窗口电流

具有失活特性的电压依赖性离子通道，若其激活曲线和失活曲线的电压范围有交叠，在该交叠范围内的电压下通道达到稳定状态时，会持续存在一个小幅而持续稳态的电流，成为窗口电流（window current）。在这一电压范围内，通道未完全失活且有一定程度的激活。窗口电流在生理环境下对心肌细胞的影响很小，毕竟重叠部分不到健康心肌细胞最大电流的5%。然而在病理状态下，钠通道的某些突变可以将稳态失活的电压更多地转移到去极化膜电位，产生“窗口”内向钠电流，从而导致心肌细胞动作电位第三阶段末出现早期后除极（EAD，early afterdepolarizations）而引起心律失常(Amin, Asghari-Roodsari, and Tan 2010)。

窗口钠电流及心室肌动作电位

晚钠电流

在心脏组织中，当心肌细胞膜去极化达到阈电位时，钠通道开放，从而产生AP的升支（即动作电位0期）。通常条件下，心肌细胞的钠通道激活后很快失活，通道关闭不再有Na+流入细胞。经过一段时间后，钠通道又恢复到原来的静息状态，以应对下一次的激动。在生理条件下，有少数钠通道激活后不完全失活，呈部分开放状态，引起钠通道关闭不全出现持续的钠内流，且这部分钠通道具有较缓慢的失活特性，这种峰钠电流后的持续性内向钠流称为晚钠电流（late sodium current，INaL）。INaL由Nav1.5编码，它参与维持AP的平台期。正常心室肌细胞中产生的INaL很弱，持续时间可达到几百毫秒，但其强度小于峰钠电流的1%，对AP影响不大(Maier 2012)。但在某些病理状态下，如缺血、缺氧时可明显增大，通过多种机制诱发心律失常的产生。

晚钠电流增大可导致AP时程延长和EAD的出现(Rajamani, Shryock, and Belardinelli 2013)

研究表明，给予INaL增强剂ATX-II后显著增加心肌细胞室性心律失常的发生率，而其特异性阻断剂雷诺嗪（ranolazine）能阻断INaL从而能够减少或抑制心律失常的发生。爱思益普致力于神经系统和心血管系统的创新药物研究，以期在心脏安全性评价方面为寻找新的治疗靶点提供实验支持。

晚钠典型图（爱思益普供图）

DRG细胞里的钠电流

待补充

【参考文献】

Amin, A. S., A. Asghari-Roodsari, and H. L. Tan. 2010. 'Cardiac sodium channelopathies', Pflugers Arch, 460: 223-37.

Brackenbury, W. J., and L. L. Isom. 2011. 'Na Channel beta Subunits: Overachievers of the Ion Channel Family', Front Pharmacol, 2: 53.

Goldin, A. L., T. Snutch, H. Lubbert, A. Dowsett, J. Marshall, V. Auld, W. Downey, L. C. Fritz, H. A. Lester, R. Dunn, and et al. 1986. 'Messenger RNA coding for only the alpha subunit of the rat brain Na channel is sufficient for expression of functional channels in Xenopus oocytes', Proc Natl Acad Sci U S A, 83: 7503-7.

Hille, Bertil. 2001. Ion channels of excitable membranes (Sinauer: Sunderland, Mass.).

Hinard, V., A. Britan, J. S. Rougier, A. Bairoch, H. Abriel, and P. Gaudet. 2016. 'ICEPO: the ion channel electrophysiology ontology', Database (Oxford), 2016.

Hodgkin, A. L., and A. F. Huxley. 1952. 'The components of membrane conductance in the giant axon of Loligo', J Physiol, 116: 473-96.

Maier, L. S. 2012. 'New treatment options for late Na current, arrhythmias, and diastolic dysfunction', Curr Heart Fail Rep, 9: 183-91.

Noda, M., T. Ikeda, H. Suzuki, H. Takeshima, T. Takahashi, M. Kuno, and S. Numa. 1986. 'Expression of functional sodium channels from cloned cDNA', Nature, 322: 826-8.

Ogata, N., and Y. Ohishi. 2002. 'Molecular diversity of structure and function of the voltage-gated Na+ channels', Jpn J Pharmacol, 88: 365-77.

Payandeh, J., and D. L. Minor, Jr. 2015. 'Bacterial voltage-gated sodium channels (BacNa(V)s) from the soil, sea, and salt lakes enlighten molecular mechanisms of electrical signaling and pharmacology in the brain and heart', J Mol Biol, 427: 3-30.

Rajamani, Sridharan, John C. Shryock, and Luiz Belardinelli. 2013. 'Pathological Roles of the Cardiac Sodium Channel Late Current (Late INa).' in Ihor Gussak and Charles Antzelevitch (eds.), Electrical Diseases of the Heart: Volume 1: Basic Foundations and Primary Electrical Diseases (Springer London: London).