揭示负调控NLR受体可维持均衡的抗分枝杆菌先天免疫应答

作者：牛良飞，罗舸洋，梁睿，邱趁丽，杨建伟，谢玲玲，张凯乐，田雨，王德成，宋曙，Howard E.Takiff，黄家颖，范小勇，高谦，晏博

第一作者及单位：牛良飞和罗舸洋为本文共同第一作者，上海市公共卫生临床中心/上海医学院基础医学院教育部/卫健委/医科院医学分子病毒学重点实验室，复旦大学

通信作者及单位：晏博，上海市公共卫生临床中心，复旦大学；高谦，基础医学院，复旦大学

Negative Regulator Nlrc3-like Maintain the Balanced Innate Immune Response During Mycobacterial Infection in Zebrafish

Liangfei Niu, Geyang Luo, Rui Liang, Chenli Qiu, Jianwei Yang, Lingling Xie, Kaile Zhang, Yu Tian, Decheng Wang, Shu Song, Howard E. Takiff, Ka-Wing Wong, Xiaoyong Fan, Qian Gao and Bo Yan

Frontiers in Immunology,  May 25，2022.

doi: 10.3389/fimmu.2022.893611.

背景

结核病是危害公共卫生安全的重大传染病之一。免疫缺陷或正在长期接受免疫抑制治疗的患者发生结核分枝杆菌感染的风险增加，但对感染的过度炎症反应也会引起组织损伤。先天免疫是宿主抵御结核分枝杆菌感染的第一道防线，平衡的先天免疫反应对于宿主成功控制结核分枝杆菌的感染至关重要。

NLRs是一类重要的胞内受体，其大部分成员为正调控因子，能够激活下游促炎因子的表达。但也有少数几个NLRs参与感知不同刺激物的免疫负调控，如NLRP10和NLRC3。目前，NLRs中的CIITA、NOD2、NLRC3和NLRP10已被证明是宿主感知结核分枝杆菌或调控抗结核免疫反应的重要因子，而且作为负调控因子的NLRC3和NLRP10的抗结核感染机制被证明是参与适应性免疫的负调控，但其是否参与宿主抗分枝杆菌感染先天免疫调控目前尚不明确。

斑马鱼具有人类保守的免疫系统，易于遗传学操作及可视化研究，且海分枝杆菌感染成鱼后能够形成与人结构类似的肉芽肿结构，被广泛用于结核病的免疫及病理学研究。我们以前期工作中鉴定的斑马鱼负调控因子nlrc3-like突变体为基础，利用斑马鱼幼鱼发育早期仅存的先天免疫系统的特点研究负调控因子NLR在宿主抗分枝杆菌感染先天免疫中的作用及机制。

方法

本研究采用斑马鱼幼鱼动物模型研究nlrc3-like缺失对于海分枝杆菌体内菌载量和生存曲线的影响。通过组织特异性过表达来确定nlrc3-like主要在何种细胞中发挥功能，并通过流式细胞分选术及RT-PCR检测感染后炎症因子在巨噬细胞水平的表达。利用遗传学手段确定其是否通过炎症小体通路参与抗分枝杆菌感染免疫调控。进一步通过活体成像及苏丹黑染色检测nlrc3-like缺失对于中性粒细胞募集的影响，并通过病理检测nlrc3-like缺失状态下中性粒细胞的募集与病理损伤的关系。最后，检测通过使用糖皮质激素干预抑制过度炎症反应是否能够回补nlrc3-like缺失的表型。

结果

我们发现斑马鱼nlrc3-like的缺乏导致了海分枝杆菌感染早期阶段的细菌负担减少，同时增加了促炎细胞因子的产生，如il-1b和tnf-a。在斑马鱼胚胎中髓系特异性过表达nlrc3-like却达到了相反的效果，这表明nlrc3-like对宿主抗分枝杆菌反应的影响主要是通过其先天免疫系统实现。通过流式细胞分选术和随后的基因表达分析表明，促炎因子的表达在nlrc3-like缺失的巨噬细胞中显著上调。通过在nlrc3-like缺失的鱼中引入炎症小体激活关键基因asc的突变，我们构建了nlrc3-like与asc的双敲除品系，并发现双敲除斑马鱼胚胎中的细菌负担与nlrc3-like单突变的胚胎相比显著增加。这意味着炎症小体激活参与了nlrc3-like突变体在宿主对分枝杆菌感染的控制。在感染晚期，我们还发现nlrc3-like缺失的胚胎相比野生型胚胎有更为严重的组织损伤和更多的中性粒细胞浸润，但两组间的菌载量却无明显差异。通过使用地塞米松处理，我们可以减轻突变体中的组织损伤和中性粒细胞浸润，降低突变体的菌株量和延长其生存曲线。

结论

研究发现了nlrc3-like主要通过限制巨噬细胞炎症小体的激活和中性粒细胞的组织浸润来实现调控宿主抗分枝杆菌先天免疫应答的作用（图1）。研究成果强调了均衡的先天免疫应答对于成功控制分枝杆菌感染至关重要，同时也为伴随过度炎症症状的结核病（与HIV合并感染中的免疫重建综合征或结核性脑膜炎等）服用激素类抗炎药物的治疗方案提供了潜在的分子机制。考虑到负调控的NLRs在结核感染的固有免疫应答中的重要作用，未来需要进一步研究鉴定结核分枝杆菌感染过程中受其调控的相关分子。

图1  宿主负调控因子nlrc3-like在分枝杆菌感染期间对先天免疫应答的影响