运动发酵单胞菌基因表达严谨调控系统的构建

iSynBio造物联合合成生物学创新大赛推出《大赛项目揭秘专题》，本期为第五期，嘉宾为湖北大学HUBU-SPEC团队，参赛项目为运动发酵单胞菌基因表达严谨调控系统的构建。

项目内容概述

运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）是一种在微生物发酵工程中非常具有前景的底盘细胞。为了在运动发酵单胞菌内实现外源基因表达的严谨调控，本团队构建了由四环素（Tetracycline, Tc）与阿拉伯糖（Arabinose, Ara）共同诱导的T7 RNA聚合酶，以及含有T7启动子的pTZ系列穿梭表达质粒（运动发酵单胞菌-大肠杆菌），成功建立了表达效率高、正交性强的T7表达系统，我们也利用该系统测试了数种外源蛋白的表达水平。

同时，我们选取具备自动分泌特性的超折叠绿色荧光蛋白(sfGFP, superfold GFP)测试其在运动发酵单胞菌的分泌能力，可以与上述建立的系统实现异源蛋白的高效表达与一步分泌。

项目背景

基因表达调控是一个具有多层次性和复杂性的过程，包括基因水平、转录水平、转录后水平和翻译水平等多个层次。对于原核生物而言，其调控表达系统诱导过程缓慢、效率低，缺乏诱导特异性和表达的精确调控等，限制了表达系统的应用。故而期望出现更丰富的基因严谨调控系统，使基因的时空表达受到高效的严谨控制，有效使用细胞的资源。 运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）是一种兼性厌氧的革兰氏阴性菌，是目前已知唯一通过Entner-Doudoroff（ED）途径进行厌氧发酵的微生物，具有基因组小，乙醇产率高，耐受高糖、高酒精，生长温度（24～45℃）和pH（4.0～8.0）范围广泛等优良特性。由于运动发酵单胞菌的这些特性，使得它在工业化生产上具有广阔的应用前景。近年来也有针对运动发酵单胞菌开展的大量系统与合成生物学、基因工程与代谢工程等方面的研究成果。

图1. 运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）

大肠杆菌中高效表达的T7 RNA聚合酶（T7 RNAP, T7P）系统已有报道，我们尝试在运动发酵单胞菌中设计类似的高效表达系统，用于严谨调控线路的构建，帮助解析有毒基因的功能及实现代谢途径在运动发酵单胞菌中的严谨调控；同时也将构建可以在运动发酵单胞菌与大肠杆菌中使用的穿梭质粒，方便质粒的构建及提高外源基因在运动发酵单胞菌中的表达效率，为后续蛋白的表达与分泌及代谢工程途径优化调控奠定基础。

项目技术线路

图2. 项目技术路线图     

通过构建四环素与阿拉伯糖共同诱导表达T7 RNA聚合酶的穿梭载体，实现具有强正交性T7表达系统在运动发酵单胞菌中的建立：T7 RNAP具备一定的毒性，所以对其表达进行调控：T7 RNAP由启动子PBAD控制，同时AraC的表达又受到Ptet调控。在没有添加阿拉伯糖诱导物的条件下，目的蛋白GFP没有表达或者表达量很低；在四环素和阿拉伯糖两种诱导物同时存在的时候蛋白表达量高。     基于pET系列质粒，通过添加运动发酵单胞菌的复制子构建有 PT7 驱动的外源基因表达的pTZ系列质粒：后续可以将带有待表达蛋白基因的穿梭表达质粒pTZ转入已建立T7表达系统的运动发酵单胞菌中，实现基因与线路的严谨调控与蛋白的高效表达。  

主要成果

  ►设计T7 RNA聚合酶表达质粒并构建转化菌株。  

图3. Ptet-AraC-PBAD-T7P基因线路模块示意图

  ►检验双质粒系统蛋白表达效果。    

我们选用绿色荧光蛋白GFP作为报告蛋白，相应的基因克隆到含有PT7启动子的pTZ22b和pTZ28a空载体上；同时将该基因克隆到不含PT7启动子的pEZ15A空载体上作为对照组。将含上述报告基因的3种质粒分别转化到重组菌株ZM-1（p39-Ptet-AraC-PBAD-T7P）中。

得到的转化菌株都含有T7 RNA聚合酶质粒和报告基因质粒。

图4. 3个双质粒菌株在不同浓度的Tc和Ara组合诱导处理下的荧光强度值

我们采用流式细胞仪检测不同菌株内GFP的荧光强度。实验结果表明，在不同浓度梯度的四环素（Tc）、阿拉伯糖（Ara）诱导下，PT7驱动的表达质粒pTZ22b-GFP、pTZ28a-GFP能够响应Tc或Ara的诱导，且具有剂量依赖性；而不含PT7的对照质粒pEZ15A-GFP不受到Tc或Ara的诱导调控。

用0.8 μg/mL的四环素和3 mg/mL阿拉伯糖组合进行诱导时，报告基因的荧光值最高。可见，双质粒系统确实可以实现目标基因的严谨控制，并且也初步实现了外源基因的大量表达。

  ►分泌蛋白的检验。    

选取3个GFP突变株：sfGFP7、sfGFP15、GFP-high，将以上3个基因克隆到pEZ15A空载体上，并分别转化到运动发酵单胞菌中，测试其单在运动发酵单胞菌内单独表达时的表达量以及分泌能力。

图5. 3个GFP突变株的荧光强度值     

通过Western Blot检测不同的GFP在运动发酵单胞菌中的分泌情况：将3个得到的转化菌株菌培养到对数期后，取定量的上清进行检测。    

图6. 3个GFP突变株上清Western Blot检测结果    

我们采用流式细胞仪检测3个GFP突变株的荧光强度，同时，取定量上清通过Western Blot检测不同的突变体的分泌情况。结果表明，突变株GFP-high的总体荧光强度低于另外两突变株，上清中也未得到相应荧光蛋白，而突变株sfGFP7及突变株sfGFP15在运动发酵单胞菌中的表达量及分泌能力远远高于突变株GFP-high，其中突变株sfGFP15的荧光强度最高，且分泌能力最强。

后续实验将以上述GFP为载体，从多肽到异源的复合蛋白，分别与其进行融合表达，确定其是否具备携带融合蛋白自动分泌的特性；除了促进细胞外分泌，也需确定sfGFP融合蛋白是否可以正确折叠成活性复合蛋白结构。

我们是来自湖北大学的HUBU-SPEC团队

 
我是熊雨欣，很荣幸担任HUBU-SPEC团队的队长，在项目中负责实验操作、总结与归纳等工作。很高兴在比赛期间能够与团队成员努力进步，同时对合成生物学有更加全面深刻的了解，希望我们的团队能够获得理想的成绩！

 
我是沈翌轩，就读于湖北大学生科院，中共预备党员。成绩专业前列，曾获得多项奖学金。科研方面现参与结构生物学领域相关课题研究。在本次比赛中任副队长，希望能拓宽知识面，尝试不同的研究方向，全面提升自我。

 
我是2019级生物技术专业学生王慕尧，是队伍中的副队长，在本次比赛中负责网页设计与海报设计。这次比赛对我而言是一次新的挑战。希望借此能够拓宽我的视野，丰富我对合成生物学的认知，提升学习能力和动手能力。

 
大家好，这里是湖北大学生命科学学院的孙德心，今年新加入到合成生物学实验室的新人成员。我在本次比赛负责统筹规划队伍成员的工作安排。今年很荣幸作为新人参与到合成生物学竞赛中，希望我们可以取得理想的成绩。

 
我是湖北大学生物科学专业的大三学生陈昭仪。在生活中，我性格开朗，善于与他人合作，对工作充满热情。我有PS等基础技能，在团队负责网页设计，日常生活中我喜欢阅读和音乐。

 
曾维，2001年生，湖北大学生命科学学院2019级在校生，生物科学专业。希望通过这次比赛提高自己的科研能力和团队协作能力，能够和团队中的大家共同进步，获得宝贵的经验。同时也可以在大赛中学习和吸取其他队伍的经验，进一步充实自己。

 
我是湖北大学19生科国重的李华秋。在此次合成生物学竞赛中负责网页的制作，希望能在此次比赛中提高自己的电脑的网页制作能力与团队协作能力，也希望最后能呈现出令自己满意的网页页面。

 
我是来自湖北大学生命科学学院19级生物技术专业的袁诗雨。通过对专业理论课的学习，具备有较扎实的基础知识，希望通过此次竞赛，进一步加强对理论知识的理解和面对问题解决问题的能力。

 
大家好！我是湖北大学的本科生刘安祺，主修生物技术专业。我进入大学以来参加了许多科研项目，我喜欢在实验中探索，并珍惜由探索得出的宝贵经验，这些经历使我获益良多。

 
我是来自湖北大学生命科学学院的邓泽宇，就读专业是生物科学。在团队中，我负责一些实验操作和海报的制作，在这个过程中我获益良多。我希望从本次大赛中体会到团队合作的快乐，收获与团队中各个成员间的友谊。

 
我是刘韩茜，湖北大学19生科国重的一名学生。目前我在生物催化与工程实验室学习，在此次合成生物学竞赛中负责实验部分工作。希望能在此次比赛中提高自己的实验设计与操作能力、团队协作与交流能力。

 
我是李贵泽，今年20岁，来自湖北大学生命科学学院2019级生科试验班。在此次比赛中，我的工作内容主要是实验操作，包括将T7系统转入到运动单胞菌。

指导老师

杨世辉

博士，教授，博士生导师，“省部共建生物催化与酶工程国家重点实验室”副主任；湖北省“楚天学者”特聘教授及湖北省“百人计划”创新人才；中国生物发酵产业协会理事会理事，中国微生物协会分子微生物学及生物工程专业委员会委员。

毕业于湖北大学（生物学学士，1993年），武汉大学（微生物学硕士，2000年），及美国加州大学河滨分校（微生物学博士，2005年）。曾先后任职美国能源部橡树岭国家实验室（Research Associate，2007-2011）及美国国家可再生能源实验室（Staff Scientist，2011-2016）。2016年底加入湖北大学生命科学学院，主要从事微生物代谢工程、合成生物学、以及绿色生物制造等方面研究；作为负责人主持多项国家自然科学基金及省部级科研项目；先后在Nature Biotechnology、PNAS等期刊发表论文 80多篇，引用3600余次，H-index 35。获美国授权专利6项、中国专利授权8项。长期担任国际学术期刊编辑及《合成生物学》编委。

合成生物学是生命科学领域一门新兴的前沿交叉学科和典型的汇聚技术。它通过融合工程科学理念与生命科学原理及基于多学科的使能技术，设计合成新的或改造天然的生命系统，揭示生命规律、构筑新一代工程生物体系；被喻为“认识生命的钥匙”（造物致知）、改变未来的颠覆性技术（造物致用）。

合成生物学创新大赛主要面向在校大学生以及在读硕士研究生。本届创新大赛包括医疗、农业、环境、制造、信息、基础研究及创新应用等多个领域，鼓励学生从兴趣出发，探索合成生物学在不同领域的创新和应用。首届创新大赛将于 2022 年 7月9-10日在深圳理工大学线下举行。

大赛由中国生物工程学会合成生物学分会指导和主办。大赛由二十多家高校和研究所共同发起。大赛的共同承办单位是中国科学院深圳理工大学（筹）合成生物学院、中国科学院深圳先进技术研究院合成生物学研究所、深圳合成生物学创新研究院、深圳市合成生物学协会、 深圳市工程生物产业创新中心、DeepTech。