【专家报告】曹洋先生：免疫细胞治疗产品临床前研究的挑战和策略

6月7日，昭衍（苏州）新药研究中心药理部总监曹洋老师在细胞治疗系列公开课【第4期】中做了主题为《免疫细胞治疗产品临床前研究的挑战和策略》的报告，本文根据专家报告内容整理，并经专家审核确认。
嘉宾简介

昭衍（苏州）新药研究中心药理部总监，昭衍易创（苏州）新药研究执行副总经理。

2005-2008年就职于Charles River Laboratories Shanghai，从事新药临床前DMPK研究的相关工作。2009-2012年于日本京都药科大学药理学实验室从事免疫疾病如支气管哮喘的发病机理方面的研究。2013年加入昭衍（苏州）新药研究中心有限公司，先后任药理部专题负责人、主任、药理部总监。期间主导并参与了超过200个新药的非临床研发策略设计、临床前药理、药效研究工作，以及超过50项细胞治疗（含CAR-T细胞）产品的非临床评价工作。

2021年任昭衍集团旗下全新的CRO服务子品牌昭衍易创的执行副总经理，全面负责公司的运营管理及科学事务。

01、免疫细胞治疗产品临床前研究的关注点

目前来说，免疫细胞治疗产品如CAR-T进行注册临床研究申请时，监管部门对临床前研究的要求并不是很高，其原因主要是受到目前科学研究手段，尤其是动物模型方面的限制等。临床前研究包括体外有效性研究，体内有效性研究、组织分布研究（药代动力学）、体外安全性研究、体内安全性研究等。主要的关注点为产品的有效性/特异性，增值代谢分布特征，在靶毒性（CRS、神经毒性）脱靶毒性，以及其他风险（免疫原性，成瘤/致瘤性）。其中CRS、神经毒性、脱靶毒性和免疫原性目前仍然是临床前评价的痛点（图1）。

图1 临床前研究的关注点

02、细胞因子释放的临床前评价

早年进行CAR-T细胞治疗产品的临床前评价时，细胞因子释放是很多人关注的重点，但是随着科学界对CRS的认识越来越深入，临床风险管理策略的成熟，因此目前对CRS相关的风险可能不像早年那么担忧。关于CRS，小鼠模型和临床患者之间是存在较大差异的，比如相对于临床患者，小鼠模型中细胞因子释放较早、种类较为单一（主要是T细胞相关）、一些临床相关的细胞因子如IL-6的释放水平也较低。当然我们在临床前过程中也遇到过由于细胞因子释放导致出现毒性反应、甚至动物死亡的案例。对于这类临床可能的CRS风险，还是应该在临床前进行充分的研究，说明毒性和细胞因子之间的关联、细胞因子的释放特征以及可能的临床风险管理方案。

虽然有时存在一些特例，但更多的情况是缺乏合适的模型去研究产品的CRS。除常规的荷瘤小鼠模型外，使用动物源细胞或者合适的人源化动物模型也是可采用的评价策略。但由于动物源性细胞和临床拟用产品相比，存在工艺上的巨大差异，并且由于动物和人之间的种属差异导致的免疫细胞的功能差异，通常会导致制备的动物源细胞和临床拟用产品之间缺乏可比性。有良好髓系来源细胞重建的人源化小鼠模型可能是评价CRS的合适模型。

03、脱靶风险的临床前评价

脱靶风险分为两种，On-target off tumor的脱靶毒性和， Off-target off tumor的脱靶毒性，其中前者是因为肿瘤相关抗原（TAA）表达在正常组织上导致的脱靶毒性，而后者则可能涉及到抗体的特异性。评价CAR-T细胞治疗产品脱靶毒性的方法主要有：确定靶蛋白在人体组织的分布特征、膜蛋白阵列研究（MPA）、人体组织交叉反应（TCR）、体外原代细胞杀伤以及相关动物种属的毒性研究结果。 膜蛋白阵列是在蛋白层面对候选分子（抗体、scFv）的脱靶可能性进行筛选，对于目前的CAR-T治疗产品的IND来说是不可或缺的。根据我们的研究经验来说，无论是MPA还是TCR研究中，观察到脱靶现象并不是罕见的事情，我们认为关键在于发现脱靶后应对的策略。无论是MPA发现非预期的结合靶点，还是TCR发现非预期的脏器组织阳性结合。
我们可以通过下列策略进行风险评估：
1. 非预期结合的靶点在组织脏器表达分布情况；
2. MPA和TCR研究的结果是否对应；
3. 临床前研究如果有相关动物种属，那么是否观察到相应的毒性反应；
4. IIT在临床患者中是否观察到相关的安全性信号；
5. 相应靶点高表达细胞株/原代细胞株的体外杀伤确证；
在过去的时候研究者在脱靶风险的评估上可能会因为缺乏研究手段感到比较迷茫，但目前是有良好应对策略的。

图2 膜蛋白阵列研究

04、GvHD对临床前研究的影响

移植物抗宿主病 (GvHD) 是广大研究者在进行T细胞相关产品异体、异种回输研究时都会遇到的问题。GvHD 对T细胞治疗产品临床前研究的影响分为以下几点，包括：1. T细胞的非特异性扩增；2. 影响生存率指标的观察；3. 影响长期试验的观察周期；4. 影响毒性靶器官的判断。

图3 毒性靶器官的判断

05、如何正确认识免疫细胞治疗产品的成瘤性/致瘤性风险

首先要明确三个概念，Tumorigenicity: 细胞增殖并形成恶性或良性肿瘤的能力。Oncogenicity：生理活性物质或化学物质诱导细胞永生化，形成良性或恶性肿瘤的能力。Carcinogencity：生理活性物质或化学物质诱导细胞永生化，形成恶性肿瘤的能力。细胞治疗产品的成瘤性和致瘤性的考量可在多个指导原则中找到相关描述，而目前也有多个细胞治疗产品被批准上市，其中6个已被FDA批准的CAR-T细胞治疗产品的资料可为我们提供重要参考。通常认为成瘤性/致瘤性风险来源分为三部分：载体和基因编辑工具、细胞成分以及非细胞成分（如表达产物）。以相对风险高低来分类的话，一般认为经过基因修饰细胞（CAR-T、TCR-T、CAR-NK）的风险较高，未经基因修饰细胞（PB-NK、PB-T、CTL、DC-CIK）的风险较低。体细胞来源的细胞属于低风险，造血干细胞来源属于中风险，多能干细胞来源属于高风险。本次讲座主要关注高风险细胞治疗产品（多能干细胞来源的细胞治疗产品）成瘤性/致瘤性风险的考量，其中包括细胞库的质量控制和研究、细胞中间体和终产品细胞制剂中混入未分化细胞的风险、细胞中间体和终产品细胞制剂混入转化细胞的风险和终产品细胞在定植部位形成肿瘤的风险。在质量研究中，对于建库细胞需确认细胞库的特性，可参考WHO和中国药典中的相关规定进行，但此类研究仅适用于均一的细胞群体的成瘤性评鉴，对于由少量细胞成分导致成瘤性/致瘤性风险的细胞制品而言不适用。而细胞产品中的未分化细胞（ESc/iPSc）保持了畸胎瘤的形成能力，因此有必要通过体外或体内的实验方法对此类细胞的数量进行质量控制。其中iPS处理成单细胞悬液后具有凋亡的倾向，因此软琼脂克隆试验可能并不是合适的评价方法。而体内实验最重要的是应该事先确认试验系统对未分化细胞的检出下限，即多少ES/Ips细胞可在动物体内形成畸胎瘤。转化细胞的检测方法也和前者类似。但如果目的仅仅为了检测未分化的细胞或者转化细胞的数量，那么体外检测的方法如qPCR法和培养法的敏感度可能更高（图4）。但如果考虑到细胞定植微环境对成瘤性/致瘤性的影响，那么进行体内试验还是有必要的。

图4 各种检测方法的灵敏度对比

06、通用型CAR-T的临床前评价

通用型CAR-T的临床重点是潜在的GvHD风险，以 TCRnegCAR-T 的细胞为例，应评价TCR敲除后对细胞扩增活性是否有影响；终产品中可能混入TCR+的细胞，导致GvHD风险，应控制风险来源细胞的残留比例；临床前研究中可进行TCR+CAR-T产品比较的长期观察实验，检测外周血或局部组织脏器是否存在TCR+细胞的扩增和浸润。如果现有的动物模型无法做到充分的风险评估，已开展的临床研究也可提供很好的证据支持。 宿主抗移植物反应（HvGR）可能影响CAR-T治疗效果，因此也要在临床前阶段关注，如CAR-T细胞的CD52敲除后对CD52抗体的抵抗性；但相对来说，由于免疫系统的复杂性，目前在评价产品的HvGR潜力时，多数动物模型，包括人源化小鼠模型的应用还是充满了挑战。
07、总结

1. 对于细胞治疗产品，临床前评价依然是提供有效性、安全性信息的重要依据；
2. 细胞因子释放的风险可通过合适的动物模型评估，应当重视临床前观察到的细胞因子释放现象；
3. 脱靶风险可通过体外研究和体内研究综合评估；
4. 合适的小鼠模型可明显减弱GvHD带来的风险；
5. 体细胞来源的免疫细胞治疗产品的成瘤性和致瘤性风险通常较低，多能干细胞来源的免疫细胞治疗产品则需要重点关注；
6. 新一代CAR-T产品对临床前研究方法和策略提出了更多的挑战；
08、互动交流

问题1：很多PI在做细胞治疗研究，FDA和中国都有很多产品获批，细胞治疗受到很多人的关注。您在分享中提到了临床前研究方法、策略和药典指导原则，但没有通用的标准，安全性、剂量等达到怎样的指标才能进入临床研究，研究者发起的临床研究在人上进行，人是具有个性化的，不同的人是否有基因型和细胞产品的关联？
曹洋老师：如果产品往临床上推进，需要做到如何的程度，分两个层面，第一做注册临床，第二是做研究者发起临床。注册临床是有比较成熟的一套方案的，但对于不同的产品也会具有临床研究思路的差异。研究者发起的临床监管具有一定的差异性，需要进行哪些有效性和安全性研究主要取决于医院伦理及PI的判断，目前来看，国家也临床研究方面的法规政策在逐渐趋向严格，以上为法规的层面的回答。另外一个角度是研究者角度，开发产品是否足够有信心给患者用，药监局指出新研发出的产品是否比现有的产品具有更好的优势，为了保障患者的权益，研究者应该在早期阶段尽可能验证自己产品的优势。

问题2：我们会做脱靶毒性的评价，材料需要表达体外的scFv，但是体外表达的scFv不容易获得，是否能够用细胞等进行替代性评价？

曹洋老师：很多研究者都会发现此类问题，理论上和实际上会有差异，体外表达不能正确折叠或者亲和力不够，如果体外无法表达所需的scFv，那么利用基于细胞的方法是可以的。如果需要做串联的scFv很难获得，那么单个scFv的分开表达也是一种策略。

问题3：工艺和临床前试验如何安排？临床前试验需要在终产品确定后进行，后续工艺变更是否需要重新进行部分或全部临床前研究？

曹洋老师：核心的安全性研究应该使用和临床拟用产品具有可比性的工艺，这点在多数指导原则中均会有所提及。其他研究如有效性研究则相对要求没有那么高，一般建议安全性研究直接用临床的产品来做。
问题4：安全性评价和药效的各个实验的顺序如何安排最有效？
曹洋老师： 常规理解要先确认有效剂量，药效学实验最先进行，这类产品的毒理学研究通常也会使用荷瘤小鼠模型来开展，因此安全性研究和药效学研究的模型尽量保持一致；其次组织分布研究可能也要走在安全性实验前面，组织分布研究可能为毒理性实验提供动物解剖时间点的依据，在很多时间点解剖的话，安全性实验的规模会过大，所以如果组织分布研究能提供细胞在体内扩增的特征的话，可以选择分布最高的时间点进行解剖来观察毒性。
问题5：您在演讲的时候提到的FMC63脱靶效力很低，但是没有提到免疫原性，免疫原性如何？
曹洋老师： 临床报道来看，FMC63是有免疫原性的，免疫原性较强。但临床前这个阶段由于使用的多数是免疫缺陷小鼠，所以评价的难度还是很高的。当然如果像评价抗体一样，把scFv单独表达、纯化出来进行动物体内的免疫原性评价也是一个可行的策略，但代价会很高。免疫原性是值得关注的，但由于目前技术手段的限制有所缺失，并不是不用做、不想做，只是目前来讲比较困难。
问题6：小鼠上进行CRS检测到什么程度才能反映出人体的CRS？
曹洋老师： 小鼠CRS和人体CRS还是有很大的区别，发生时机不一样，人体上CRS几天后才能发现，小鼠中则在几个小时就可以发现。这种差异可能提示，人体中的CRS不是原代CAR-T释放的，可能扩增后的T细胞激活其他免疫细胞如巨噬细胞、单核细胞后发生的。而小鼠体内可能是一个快速的反应，主要由原代回输的CAR-T导致的，所以目前来说，虽然部分小鼠模型上已经做到和临床比较接近了，但是否就能预测临床了，可能还不能这么下断言。
问题7：FDA上市的CAR-T没有做安全药理实验，国内申报需要做安全药理实验吗？
曹洋老师：实际操作中一般不开展额外的或独立的安全药理实验，只是结合在毒理性实验中同步进行观察，尤其是神经毒性风险。但是如果产品有这方面的担忧，比如CAR-T细胞直接通过中枢神经系统注射，可能被要求开展独立的药理实验。

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