万字综述分享：mNGS在下呼吸道感染诊断中的应用和挑战

本期《精准前沿》栏目分享卫生部临床检验中心李金明教授及其研究团队发表于Journal of Advanced Research（IF = 10.5）上的一篇综述[1]，该综述从多角度阐述了宏基因组下一代测序在下呼吸道感染诊断中的潜在应用和挑战。

背景介绍

下呼吸道感染（LRI），包括社区获得性肺炎（CAP）、医院获得性肺炎、支气管炎、细支气管炎和气管炎，位列死亡原因第五位。据报道，2015年，LRI导致全球274万人死亡。 LRI由多种病原体引起，如细菌、病毒、支原体和真菌，其临床表现多难以区分。尽管进行了系统临床检查，高达62%的CAP病因仍未明确。由于未鉴定到明确病原体，对于患有严重LRI的患者，通常只能经验性使用广谱抗生素来缓解他们的初发症状。一旦确定了病原体，临床医生需调整或停用上述经验性治疗。然而，如果后续患者反应良好或没有检测到病原体，这种经验性干预就会持续，进而导致广谱抗生素滥用。此外，临床医生可能会错误地将症状归类为非感染性炎症并给予经验性皮质类固醇治疗，这可能导致再次感染。

快速准确地检测病原体可实现个体化治疗，减少广谱抗生素滥用，以及促进患者最终康复。微生物培养，作为微生物鉴定的金标准，不仅耗时，而且灵敏度低，尤其是对一些难检的生物体。免疫学检测以及核酸PCR检测，不依赖于培养技术，快速准确，但这些方法需要病原体类型的先验知识或假设。宏基因组下一代测序（mNGS）可以作为一种新的工具来解决传统诊断方法的不足。mNGS的主要优势在于其无偏采样，能够同时检测同一样本中所有潜在病原体并且避免预先设定检测范围。因此，在诊断不明原因和共感染LRI中mNGS具有明显优势。

mNGS是一种检测新型微生物或罕见微生物的有用技术。在难检测微生物和肺部共感染的检测方面也能够有效提高灵敏度。相比于微生物培养技术，mNGS的结果不受检测前抗生素干预的影响。除了病原体鉴定，mNGS还提供了额外基因组信息用于呼吸道微生物组分析、人类宿主反应分析和耐药性预测，所有这些都有利于LRI患者的临床干预（图1）。然而，采样过程中的样本误差（采样时间、宿主DNA水平、污染）和方法学中的技术误差（不同核酸酸提取方法、不完整数据库、差异化生物信息学工具和非标准化解读标准）限制了其在临床中的广泛使用。 这篇综述从多角度阐述了mNGS在下呼吸道感染患者干预中的潜在应用和挑战，旨在帮助临床医生和科研人员全面理解mNGS。

图1. mNGS在下呼吸道感染领域的应用

应用场景

1. 下呼吸道感染的诊断

mNGS作为一种不依赖培养的、无偏的、无假设策略，近年来已发展成为一种呼吸道感染的诊断方法。目前LRI的分子诊断通常是病原体特异性的，临床医生根据患者症状选择相应测试，而当新型或意料之外病原体出现时，这种策略就面临着挑战（表1）。相比之下，mNGS可提供检测样本病原体全景图，在不明原因肺炎诊断中能检测到新型罕见病原体。例如，2019年12月上旬，不明原因重症肺炎出现在中国湖北省武汉市。2020年2月3日，基于RNA的mNGS鉴定到了新型冠状病毒(SARS-CoV-2)可引起肺炎。与鉴定SARS所需的时间（五个月）相比，mNGS极大地缩短准确鉴定病毒基因序列所需时间到5天。此外，在不明原因肺炎的诊断中，mNGS可为鉴定罕见病原体和减少病情延误提供线索。例如，人类感染鹦鹉热衣原体后会出现不同严重程度的肺炎，CAP占比不到5%。鹦鹉热衣原体感染的诊断在临床上具有挑战性，因为传统基于培养的方法耗时且产出低，血清学检测可能与其他衣原体科物种发生交叉反应。尽管基于PCR的方法更加快速、灵敏和特异，但只有在临床医生要求进行相应检测时才能实施。检测范围宽泛和疑似病原体漏检使得mNGS成为诊断鹦鹉热肺炎的一种有效策略。

表1. mNGS在呼吸道感染诊断中的分析性能

对于难培养或培养时间较长的病原体，传统培养方法检出率低。mNGS作为一种不依赖于培养的检测方法，有望在更短时间内检测出这些病原体。有研究团队采用561名急慢性感染患者队列评估mNGS在真实临床实践中的应用。结果显示mNGS在感染疾病诊断中的灵敏度为50.7%，特异度为85.7%。此外，mNGS的检测性能优于依赖培养的技术，尤其是对难检病原体如结核分枝杆菌、病毒、厌氧菌和真菌。与组织病理检测相比，在评估肺活检组织真菌时，mNGS特异度达到了100%。结核分枝杆菌 (MTB) 培养时间长，检出率低。有研究团队证明mNGS对MTB的检测灵敏度为47.92%，这与X-pert (45.83%) 和培养(46.81%) 一致。然而，mNGS只需要三天时间就能检测出67.23%的MTB感染病例，而传统方法需要超过90天时间才能检测到49.58%的MTB感染病例。目前，大多数mNGS平台的平均典型周转时间(TATs) ，从样本接收到出具最终结果为48小时。据报道纳米孔测序技术甚至可以将TAT缩短到6小时。与传统基于培养的方法相比，细菌培养的平均TAT为3天，真菌为7天，分枝杆菌为45天，mNGS的TAT为2天，对临床实验室来说是可以接受的。mNGS优化了难检病原体检测，加快了临床决策过程并促进了合理抗生素治疗。

与传统检测相比，在单次检测中，mNGS对病原体的检测范围广，从而简化了临床肺部共感染的诊断。一项回顾性研究通过55 名入组的混合性肺部感染患者来评估mNGS分析性能。该研究发现mNGS对诊断混合性肺炎的灵敏度高于常规检测（97.2% vs. 13.9%；P < 0.01）；然而，特异度较低（63.2% vs. 94.7%；P = 0.07）。有研究团队采用mNGS评估75名受检人群的RNA呼吸道病毒感染状态。该研究表明，mNGS与用于检测SARS-CoV-2的逆转录PCR (RT-PCR)结果100%一致（n = 45, 60%），与此同时，mNGS还检测到了常规检测中漏检的合并感染（n =1, 2.2%）和其它病毒感染（n = 4, 13.3%）。mNGS检测到的SARS-CoV-2序列数以及RT-PCR检测到的循环数之间也存在相关性。

患者在检测前使用广谱抗生素往往会导致传统培养方法的“假阴性”结果；与之相比，mNGS受抗生素治疗的影响较小。一个研究报告称，在检测前没有使用过抗生素的患者中，mNGS和传统培养在检测灵敏度上没有显著差异（43.3% vs. 36.7%；P = 0.10）。然而，在检测前使用过抗生素的患者中，mNGS的检测灵敏度显著高于传统培养（52.7% vs. 34.4%；P < 0.01）。

2. 呼吸道微生物组分析

呼吸道微生物组是在健康受试者和呼吸系统疾病患者呼吸道中共存的微生物集合。NGS的出现极大地促进了微生物组分析，因为它使测序变得更加方便快捷。此外，mNGS 的发展是微生物组领域进步的基石。mNGS将获取的序列信息映射到微生物资源数据库，能够克服靶向检测方法局限性，通过单次检测来表征人体系统内所有微生物。

据报道，20-50%健康人呼吸道会有机会病原体寄居，例如肺炎链球菌和流感嗜血杆菌，因此建立LRI生物标志物来评估微生物检测结果的临床意义至关重要。先前一项研究对52名鼻内接种甲型H3N2流感病毒的健康成年参与者和35名健康成年对照参与者进行了细菌16S核糖体RNA测序。与健康对照组相比，H3N2感染并没有改变咽部微生物群，没有导致微生物群在门或属水平上的波动。健康成年参与者具有稳定的上呼吸道微生物群和强大的免疫系统，流感病毒对口咽部微生物群影响不大。相比之下，一些研究已经证明了低免疫水平LRI患者的微生物群多样性丧失，可作为感染的生态标志物。有研究团队对22名接受造血干细胞移植的急性呼吸系统疾病患者进行了基于RNA的mNGS分析。研究发现检测到LRI病原体的患者微生物群Simpson多样性指数显著高于未检测到LRI病原体的患者。另一项对92名急性呼吸衰竭患者进行mNGS的研究表明，LRI与患者体内呼吸道微生物组α多样性和患者间呼吸道微生物组β多样性降低有关。此外，他们基于RNA的mNGS，采用α多样性预测LRI，在验证队列中AUC值为0.8。目前，用于疾病诊断的微生物组检测尚未得到临床验证，但mNGS可用于呼吸道微生物组分析，作为生物标志物来区分感染性或非感染性疾病。

3. 人类宿主反应分析

通常，基于RNA的mNGS比基于DNA的mNGS更复杂，但前者可以解决几个后者无法解决的问题。例如，基于RNA的mNGS对检测RNA病毒特别有用，但是基于DNA的mNGS会发生漏检。基于DNA的mNGS无法区分活细菌和死细菌，但是基于RNA的mNGS能够检测活病原体。

基于DNA的mNGS旨在测量每个物种的基因组数量，而基于RNA的mNGS可测量基因表达。因此，基于RNA的mNGS不仅可用于物种分类，还可在单次检测中评估宿主反应，在临床上作为区分非传染性或传染性疾病、细菌或病毒感染的辅助检查。因急性呼吸系统疾病住院的个体中，与未明确病原体的患者相比，在有明确病原体的患者中可观测到与免疫应答相关的基因表达水平显著上调。Langelier研究团队使用基于RNA的mNGS来研究LRI患者与非LRI患者之间的基因表达差异。他们发现前者富集的通路包括：先天免疫反应、NF-κβ信号转导、细胞因子和I型IFN反应，而后者富集的通路包括：氧化应激反应和MHC II类受体信号转导。此外，该团队还发现病毒和细菌感染中的四个差异表达基因（RSAD2、OAS3、CXCL2 和 DUSP2），反映了可提示病原体类型的不同宿主反应模式。有研究报道宿主基因表达分类器在区分细菌或病毒呼吸道感染方面达到了78-87%的准确率。炎症和中性粒细胞基因的表达水平在细菌性LRI患者中通常发现会显著上调，而抗病毒免疫反应相关的基因如干扰素的表达水平在病毒感染LRI患者中会显著上调。充分挖掘mNGS中冗余基因组信息来分析人类宿主反应为全面表征感染状况提供了新视角和方法。

4. 耐药预测

仅提供病原体鉴定结果远远不足，还需检测临床相关抗生素抗性基因（ARGs），进一步预测病原体抗性来指导患者管理。目前，大多数临床微生物学实验室依赖于传统培养的表型方法（例如梯度扩散、圆盘扩散等）和不依赖培养的分子方法来评估耐药性状态。然而，所有依赖于培养的方法都存在固有缺点，例如耗时、劳动密集、主要微生物种群偏倚，以及污染生物体过度生长的风险。分子方法是快速的，但只有一小部分主要的ARGs可以通过传统的分子方法进行靶向检测，这些ARGs仅来自数量有限的常见病原体。

随着测序技术的发展，依赖于培养的检测技术可通过全基因组测序（WGS），不依赖于培养的检测技术可通过mNGS来预测耐药性。与WGS相比，由于mNGS不依赖于培养，更利于评估生长缓慢，难培养病原体，以及因抗生素暴露而致死病原体的耐药性。

尽管不依赖于培养的mNGS很有吸引力，但仍有许多问题需要解决。最近一项研究使用纳米孔宏基因组学技术对细菌LRI进行诊断，从41份患者呼吸道样本中检测出183个ARGs。然而，只有24 (13.11%)个ARG与通过抗菌药敏试验观察到的耐药性相匹配。在其他检测到的基因中，16个基因没有与培养分离株的表型相匹配，接近检测到的1/3基因（56/183）可能来源于正常或定植的呼吸道菌群，有些基因甚至不可能来源于实验室培养的物种。目前，大多数mNGS诊断平台基于短读测序，因此很难确定检测到的ARGs来源于病原体基因组，而不是正常菌群或环境污染。快速TAT的纳米孔测序可产生足以跨越重复区域的长读长，这有利于ARGs分析，但准确性有待进一步提高。再者，没有分离病原体来用真实药敏试验验证预测的耐药基因，因此不确定检测出的ARGs是否与耐药性表型相关。此外，评估ARGs检测灵敏度和特异度需要对存在于样本中的所有细菌进行分离和测序，这对于评估ARGs的分析验证，临床验证和临床效用是一个巨大的挑战。

应对挑战

1. 测序平台

测序仪是宏基因组测序的物质基础，仪器的选择主要根据性能指标和临床需要。目前，Illumina测序的技术成熟度和平台范围都无法比拟，仍然主导着短读长测序宏基因组研究领域。Illumina平台采用桥式扩增技术，单个DNA分子模板首先与固定在流动池载玻片上的接头杂交，然后局部扩增成克隆簇。接着进行边合成边测序反应，每个循环反应在3’添加单个末端终止脱氧核苷酸（dNTPs）来生成互补DNA，荧光标记核苷酸的光学信号对应不同的dNTP（A、G、T 或 C）。Illumina提供了一系列广受欢迎的平台，从小型低通量台式装置到大型超高通量仪器。为了达到良好的样本覆盖率，更高通量的HiSeq和NextSeq等仪器被广泛用于mNGS。HiSeq系列平台具有高通量和相对较长读取长度（125 bp/150 bp）的优势，但长的运行时间（3.5天）限制了其在临床中的快速病原体检测。2018年，HiSeq平台已被淘汰，NextSeq系列测序系统因其中通量和较短的测序时间占据了临床病原体检测的主流测序平台。表2列出了目前可用于病原体检测的测序平台参数。

表2. 可用于病原体检测的测序平台参数

2. 去人源核酸

呼吸道样本通常含有大量人源核酸，这会降低检测低丰度病原体的灵敏度。鼻咽抽吸（NPA）样本中，95%的原始NGS序列来自人源DNA。对不需要的人源DNA进行测序并通过计算从NGS数据集中去除人宿主DNA既浪费又耗时。去除不相关人源DNA或RNA会增加微生物来源序列的相对占比。

目前去除人源核酸方法可在核酸提取前或核酸提取后进行。核酸提取前去除人源核酸的方法包括使用化学试剂（例如皂苷）或渗透裂解液选择性裂解人源细胞，然后使用脱氧核糖核酸酶 (DNase) 或单叠氮丙啶 (PMA)降解释放出的人源核酸，仅保留用于下游分析的完整微生物。Hasan等人比较了皂甙、Tween-20、Triton X-100和Chaps Cell Extract 158缓冲液（New England Biolabs）选择性裂解人源细胞的效率，并使用Turbo DNase进行裂解后处理。在脑脊液 (CSF) 和 NPA 标本中，浓度为0.025%的皂苷去人源效率最高，可将病原体DNA与人源DNA的比值增加约30至100倍。此外，与未处理样本相比，处理后样本在CSF和NPA中分别富集了40倍和170倍。最近一项纳米孔测序研究提出了一种优化的基于皂苷的宿主DNA去除方法，用于细菌LRI诊断，可从呼吸道样本中去除高达99.99%的人源DNA。Marotz等人开发了一种新方法，该方法采用渗透裂解以及10 μM PMA处理以富集人口腔样本中的微生物DNA，并将其性能与四种用于宿主去除的市售试剂盒进行比较：5-μM 过滤 (Fil)、QIAamp DNA Microbiome Kit (QIA)、MolYsisTM Basic (Mol) 和 NEBNext Microbiome DNA Enrichment Kit (NEB) 。与原始样本中人源序列的平均占比 (89.29 ± 0.61%) 相比，采用lyPMA (8.53 ±2.08%)、QIA (29.17 ± 5.04%) 和 Mol (62.88 ± 3.46%) 处理能够显著去除宿主序列，但采用NEB试剂盒处理没有观察到差异(90.83 ± 0.77%) 。总而言之，核酸提取前去除人源核酸的方法假设人类细胞膜比大多数病毒衣壳或微生物细胞壁更脆弱。这些方法牺牲了检测某些特殊无细胞壁病原体（如寄生虫或支原体）和死亡微生物游离核酸的灵敏度。此外，由于使用了额外试剂，不可避免地存在增加外源性背景污染的风险。对临床样品中的细胞和无细胞成分进行物理分离（如物理过滤和离心）是一种减少人源核酸的简便方法。该方法的一个缺陷是除去完整的或细胞内微生物后微生物序列数会大幅减少。

核酸提取后去除人源核酸的方法可以克服核酸提取前去除人源核酸所遇到的问题并提供有吸引力的替代方案。对于DNA文库，一种方法是利用甲基化CpG结合区域选择性分离甲基化宿主DNA和微生物DNA。这种方法减少了宿主基因组序列占比50倍并增加了细菌和疟原虫序列占比8-11.5倍。对于RNA文库，去除人源rRNA或线粒体RNA序列的方法是成熟的，而且是专为转录组分析设计的。去除人源rRNA或线粒体RNA可间接增加微生物序列占比并提高病原体检测的分析灵敏度。RNA文库的去除方法包括使用探针捕获联合磁珠吸附或RNase H处理，使用人源RNA抗体，使用CRISPR-Cas9选择性切割不需要的物种。近年来开发了一系列更简单、成本效益高和优化的方法来去除 人源rRNA。Culviner等人最近开发了一个方法（“do it yourself”套件），它基于特定生物素化寡核苷酸与23S、16S和5S rRNAs的杂交，之后通过链霉素包被的磁珠沉降。处理后，基于RNA的mNGS中75-80%的序列来自mRNA。2016年，Gu等人通过CRISPR-Cas9技术选择性去除来自真核生物cDNA库中不需要的高丰度序列。该方法也称为DASH（通过杂交去除丰富的序列），可去除真核生物线粒体中大于99%的线粒体rRNA。最近，Prezza等人评估了DASH在细菌短读长RNA-seq中的性能，它去除了 RNA文库中56-86%来自肠沙门氏菌和多形拟杆菌的rRNA。

3. 核酸污染

外源性微生物的核酸污染无处不在，可在湿实验各个步骤引入。未有效处理污染可能导致假阳性结果，甚至会掩盖低剂量生物样本信号（例如，皮肤拭子）。mNGS中的污染类型包括外部污染和内部或交叉污染（图2）。外部污染源于样本外微生物，例如操作者身体、实验室环境、耗材和试剂。污染源的物种谱在不同实验室间各不相同，而且随着不同研究人员和时间推移不断变化。后者是在样本处理或测序过程中由同批次其它样本交叉污染导致的。例如，不合规操作流程或微生物气溶胶可能会将上样量高的病原体引入同时间段操作的其它样本中。此外，Illumina测序过程中的标签错配，合成过程中的引物或接头污染可能导致不同样本间的串扰。

图2. mNGS可能的污染源及消除污染的注意事项

虽然不可能完全消除污染，也很难区分污染和样本微生物序列，仍然有必要尽量减少污染影响。可以借鉴其他分子检测方法来降低污染，例如保持单向工作流程和严格物理分离，使用10%次氯酸钠全面清洁材料和表面，使用超纯化试剂，记录试剂盒批号，以及定期进行污染监测。每次上机中，应检查与真实样本平行测序的空白对照。预先设定的阴性对照还可追踪潜在污染来源。例如，将噬菌体λ掺入不同试剂中来监测试剂盒污染。

作为上述实验方法的补充，许多生信方法也可用于污染去除。最常见的生信去污方法包括过滤低于相对丰度阈值的序列，但存在真实低频序列被丢弃和大量污染序列干扰下游分析的风险。另一种简单方法是减去出现在阴性对照中的序列数。由于交叉污染而存在于阴性样本中一定丰度的真实序列可通过这种方式去除。建议每个mNGS实验室都维护一个专有数据库，包含来自于正常群落或实验室环境的背景微生物。该“黑名单”中的微生物要么不报告，要么需更高的阈值用于报告临床意义。最近，一款用户友好的R包decontam (https://github.com/benjjneb/decontam)已被用于mNGS序列的污染序列识别和去除，可轻松与现有mNGS分析流程集成并且几乎没有增加额外测序成本。此外，Zinter等人对decontam进行逻辑扩展，建立了一种统计方法来计算给定物种的序列数，该序列数基于污染序列数和上样量之间反向线性回归预测。

4. 定植和感染的区分

与许多无菌部位相比，大量微生物在呼吸道定植。呼吸道样本mNGS检测的微生物可分为以下三种类别：疑似病原微生物、定植微生物和污染微生物。识别和去除mNGS中污染微生物已在上述充分讨论。mNGS用于LRI诊断的核心挑战是区分病原体和定植微生物，这使得解读复杂化。

通常，大多数呼吸系统mNGS检测使用定量或半定量统计分析来区分真正的病原体和定植菌。表3列出了在LRI诊断中通过mNGS检测病原体的阈值。mNGS检测肺部感染病原体通常会采用一些指标，例如在属水平的相对丰度，归一化为每百万条的序列数，比对到靶微生物上的序列数以及非重叠区域基因组覆盖率。Langelier等人在生信流程中通过z值来区分病原体和背景微生物。最近一项研究开发了一种基于规则的模型和逻辑回归的模型来区分可能病原体和呼吸道共生微生物，这两个模型在验证队列中都实现了95.5%的准确率。

表3. LRI诊断中通过mNGS检测病原体的阈值

此外，生物体的临床意义应该是由常规检测、宿主条件和抗生素使用综合判定。定植微生物可能会超过呼吸道微生物群落而在一部分有基础疾病或低免疫力患者中引起LRI。宿主状态评估，包括临床表现，免疫水平和基础疾病，在判定真实病原体时是必需的。使用靶向抗菌药物后患者病情的变化也可作为指标来判定mNGS检测到的微生物是否为真病原体。准确鉴定病原体以及提供用药指南是微生物检测的最终目标。临床医生和研究人员都必须熟悉病毒样本类型中常见的微生物群落并结合他们的专业知识得出正确诊断。

5. 生物信息学挑战

高通量测序技术目前已得到了普遍应用，可在临床样本单次检测中产生大量数据。这种数据爆炸带来了数据存储和安全方面的挑战。数据存储的数量，空间和时间需认真考量并且采取恰当措施保护患者测序数据和信息。从庞大数据库中快速准确解码临床相关信息是mNGS应用于感染疾病诊断的重难点。典型的mNGS生物信息学分析流程是一个复杂的过程，包括预处理（低复杂度，低质量序列去除和接头修剪），人宿主序列去除，比对到参考数据库以及物种分类。为方便这些生信流程，一些用户友好和自动化的平台已开发出来，例如SURPI+、Taxonomer、CosmosID和OneCodex。这些实用生信工具包的开放将进一步促进mNGS融入临床微生物实验室。另一个挑战是数据库的选择可能会影响宏基因组分析的准确性和可靠性。大而全的国家生物技术信息中心（NCBI）核苷酸数据库包含所有已知生物的基因组信息，这增加了检测到罕见感染的可能性。然而，NCBI包含错误信息，如低复杂度序列、错误的物种注释、人源DNA污染、测序载体和接头，所有这些都可能导致假阳性结果。一些数量有限但高质量的数据库现在也可供使用，例如FDA-ARGOS或FDA病毒参考数据库，可确保初始微生物检测的准确性和可靠性。这些不完整数据库收录有限微生物，可能会导致假阴性结果。合并来自多个数据库的注释序列有助于改进微生物鉴定的准确性。此外，临床参考数据库必须定期更新以跟踪最新版本并修改错误注释和其他数据库错误。

6. 其它挑战

mNGS的复杂流程在临床实践中涉及多个环节，这对其全面应用提出了挑战。除了技术挑战，其他因素也限制了其广泛应用，例如不完善的质量保证、高成本、测序深度考量等。

完善的mNGS性能验证是mNGS从实验室到临床的第一步。目前，尚无美国食品和药品监督管理局 (FDA) 批准的关于mNGS的方法、仪器和/或数据库，所有内部开展的mNGS测试都是实验室自建项目 (LDT)。在LDT应用于临床之前，需要用已建立的性能指标进行概念验证，既耗时又极其昂贵。2020 年11月，欧洲下一代测序临床病毒学会 (ENNGS) 确立并发布了对病毒mNGS湿实验流程的推荐；最近还发布了生信流程的推荐。必须通过内部质量控制 (IQC) 监测所有上机测试的各个环节性能，包括分析前、分析中和分析后。一系列针对mNGS的能力测试（PT）会陆续推出，这将有助于mNGS的应用和标准化。

目前，高成本是制约mNGS在临床广泛应用的瓶颈之一。虽然测序成本自2014年以来急剧下降，平均每个样本mNGS的价格为1000美元至2500美元。有研究报道，在中国，mNGS 的平均成本为3000人民币（大约400美元），高于任何一种单一的传统病原检测（培养检测：600-700元，隐球菌抗原检测：320元，曲霉菌血清学检测：600元，结核杆菌斑点检测：600 元）。然而，mNGS能够在单次检测中识别所有潜在病原体，这可能比一系列传统病原体筛查更划算。为验证mNGS在临床上的适用性，迫切需要更多前瞻性临床研究以及关注其在改善患者治疗结果上的成本效益经济数据。对测序技术创新的鼓励和实验室自动化的普及将有助于降低成本。

mNGS需要测多少序列是另一个需要回答的问题。对于测多深，目前没有硬性和明确的规则。测序深度的选择高度依赖于预期结果和预算。例如，如果mNGS旨在分析 ARGs，与仅识别未知病原体相比，需要测的更深。由于病毒序列在临床样本中的占比通常比较低，ENNGS推荐每个样本需测大于10M的序列。对于LRI的诊断，报道的测序深度从2M到25M不等。在测序深度达到每个样本20M序列对的情况下，Chen 等人评估了实验室自建的mNGS检测在诊断LRI和分析宿主免疫反应中的临床效能。Graf等人比较了基于RNA的mNGS和呼吸系统病毒Panel（RVP）在鼻咽拭子检测中的分析性能。结果发现测序深度为5M到10M时，mNGS和RVP的一致性可达到93%。当每个样本的测序深度低于5M时，由于深度不够，会出现假阴性结果。增加测序深度将产生更高的分析灵敏度，但这是以高成本为代价的。在BALF的mNGS中，高达90%的序列是宿主来源的，在测序前去除这些序列可能会提高灵敏度，同时降低成本。因此，建议每个实验室都应根据根据他们的实际情况确定测序深度。

结语

2014年，mNGS成功诊断出一名14岁男孩神经钩端螺旋体病的经典案例，让mNGS在传染病诊断中的应用成为公众关注焦点。目前，mNGS已越来越多地用于无偏检测感染患者临床样本中的病原体。LRI作为感染的主要原因，是mNGS可以发挥作用的领域。随着自动化技术发展，目前复杂的人工操作和数据分析、高成本等障碍将被消除。为确保准确性，应验证所有正在进行的mNGS LDT以确定其性能指标。定期开展IQC和PT项目，促进mNGS检测标准化。一旦证明了分析有效性，就需要精心设计前瞻性临床试验来证明mNGS在诊断LRI或其他传染病中的临床效用。特别是，鉴于SARS-CoV-2大流行背景，mNGS已证明其在监测和跟踪疫情爆发方面的关键作用。我们认为mNGS将成为未来十年传染病诊断领域的重要工具。

LRI: lower respiratory tract infection, 下呼吸道感染

CAP: community-acquired pneumonia, 社区获得性肺炎

mNGS: metagenomic next-generation sequencing, 宏基因组下一代测序

MTB: Mycobacterium tuberculosis，结核分枝杆菌

TATs: Turnaround Times, 周转时间

AUC: Area under curve, 曲线下面积

ROC: Receiver operating curve, 受试者工作曲线

ARGs: Antibiotic resistance genes，耐药基因

WGS: whole genome sequencing, 全基因组测序

dNTPs: deoxynucleotides，脱氧核苷酸

DNB: DNA nanoballs, DNA纳米球

SMRT: single molecule real-time sequencing, 单分子实时测序

ONT: Oxford Nanopore Technologies, 牛津纳米孔技术

NPA: nasopharyngeal aspirate, 鼻咽抽吸液

CSF: cerebrospinal fluid, 脑脊液

FDA: Food and Drug Administration, 食品和药品监督管理局

LDT: laboratory-developed test, 实验室自建项目

IQC: internal quality control, 内部质量控制

PT: proficiency testing, 能力测试

参考文献：

[1] Metagenomics next-generation sequencing tests take the stage in the diagnosis of lower respiratory tract infections. Diao Z, Han D, Zhang R, Li J.J Adv Res. 2021 Sep 29;38:201-212. doi: 10.1016/j.jare.2021.09.012. eCollection 2022 May. PMID: 35572406

撰写丨SC

编辑、排版丨SX