厌氧菌简史及在正常人体菌群中的作用

引言厌氧菌是人体内可分离培养的主要微生物。虽然早在20世纪初人们就知晓厌氧菌具有致病作用，但厌氧菌常常被忽视，部分原因在于不同的临床实验室在实施推荐的厌氧菌分离培养和鉴定方法时存在很大差异。有些很重要的因素会妨碍对部分厌氧菌的检测：医疗资源匮乏，以及认识不到需要检测厌氧菌，这在某种程度上取决于医疗保健机构的大小和服务的人群。医生的需求也是影响因素。不过，几乎在所有实验室中，革兰染色常能发现这些细菌常见的独特形态。培养条件苛刻，通常限制了检出率。厌氧菌在皮肤黏膜表面无处不在，由于难以避免正常菌群的污染，不易取得有意义的培养结果。如果存在包括其他已知病原体的混合菌群，常需临床专家来鉴别需要治疗的病原体和无需治疗的共生菌或共生体。近几十年来，人们通过从感染部位检出厌氧菌、应用抗生素有效、阐明致病因子并在实验动物中重现疾病，证明了厌氧菌具有致病作用，因而对厌氧菌感染重新燃起兴趣。当今时代，人们通常会假定病灶内存在厌氧菌，并应用特效抗生素进行针对厌氧菌的治疗。厌氧菌的定义厌氧菌是指在缺氧条件下生长，且不能在空气二氧化碳浓度10%时在表面生长的细菌，根据其对氧气的耐受程度可进一步分类：严格厌氧菌只能耐受＜0.5%的氧气；临床上重要的厌氧菌大多是能耐受2%-8%氧气的中度厌氧菌，包括脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、黑色素普氏菌[Prevotella melaninogenica，以前归为产黑色素拟杆菌(Bacteroides melaninogenicus)]和具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)。这些微生物大都能在空气中存活一段时间，但在大气氧环境下不能繁殖。历史背景厌氧菌的发现需归功于路易·巴斯德；1862年，他在缺乏大气氧的环境下成功培养出酪酸梭菌(Clostridium butyricum)。19世纪90年代，巴黎医学院的Veillon和Zuber发表了一系列重要论文，论述了厌氧菌使多个解剖部位感染产生腐臭分泌物的作用，包括盆腔感染、脑脓肿、肺坏疽和阑尾炎。19世纪末，人们已充分了解经典的毒素介导的梭菌综合征(气性坏疽、肉毒中毒和破伤风)。1890年，人们通过纯培养分离得到了破伤风梭状芽胞杆菌(Clostridium tetani)，也开始了破伤风免疫预防的研究。20世纪初，有很多法国和德国的文献论述了厌氧菌在多种感染中的作用，其中很多被描述为“梭状螺旋体感染”，特征为存在革兰阴性梭状杆菌(可能是核梭杆菌)和厌氧螺旋体。现在看来，这些感染很可能类似于当前临床上发现的感染，但这些微生物因为具有独特的形态特征，所以引起了人们浓厚的兴趣。

发病机制研究

Schottmueller发现厌氧链球菌才是产褥期脓毒症的主要病原体，而非A组乙型溶血性链球菌，这是最重要的发现之一。他推测引起感染的病原体是正常生殖道菌群，即内源性感染。这在当时是一种新观点，因为当时人们认为几乎所有感染病都是外源性和传染性的。美国研究人员在20世纪早期做出了一些贡献，例如20世纪20年代末，David Smith开展了有关肺脓肿细菌学和病理生理学的标志性研究。他指出，尸检时在脓肿壁内发现的微生物类似于龈沟中的细菌，因此推测感染是由误吸龈沟细菌造成的。后来，有人给实验动物气管内接种牙周脓液，演示肺炎在一系列引人注目的实验中，研究者从接种物中分离出了17种微生物，然后用其单独或联合在不同动物中进行气管内激发。最终发现，重现肺脓肿需4种微生物：厌氧链球菌、厌氧螺旋体、厌氧弧菌和厌氧梭状杆菌。这是有关微生物协同作用的早期研究之一，证明≥2种微生物可产生成分更简单的接种物无法再现的病变。美国外科医生Meleney和Altemeier也做出了重要贡献。Meleney发现并记录了厌氧菌在软组织感染中的作用，后来这种疾病被命名为“Meleney慢性协同性坏疽”，这是一种发生在留置缝线处的罕见但极具特征的侵蚀性溃疡。这种病灶内包含金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和厌氧链球菌，只有在两者均接种的情况下才能在实验动物中重现。20世纪30年代晚期，Altemeier研究了阑尾炎的细菌学，并能在100例患者的96例中分离出厌氧菌。他还指出，只有存在厌氧菌感染的情况下才会有腐臭分泌物，也只有这些微生物在体内及体外均可产生这种特征性的恶臭味。1940-1960年，人们对厌氧菌感染的兴趣大减。临床报道相对较少，临床实验室也未再致力于通过培养检测厌氧菌。厌氧菌似乎淡出了人们的视野。20世纪60年代中后期，在同时出现3项研究进展后，人们对厌氧菌感染重新燃起了兴趣：厌氧罐(GasPak jar)的问世使得大部分微生物实验室能相对容易地分离出厌氧菌。主要通过弗吉尼亚理工学院工作人员的艰苦研究，最终整理出了厌氧菌的分类系统。Sydney Finegold等在体外和临床试验中研究了抗生素的抗厌氧菌活性，结果最初凸显了林可霉素潜在作用，后续研究则针对克林霉素、甲硝唑、头孢西丁等多种抗生素。1970-1980年的研究发现，厌氧菌造成了大量感染，但感染频率受解剖部位和感染机制(外源性 vs 内源性)的影响较大。实验室对厌氧菌的检出率也存在较大差异，取决于收集、运输和处理标本的方法。一项研究汇总了20世纪70年代早期梅奥诊所的资料，发现大肠埃希菌(Escherichia coli)是革兰阴性杆菌菌血症最常见的病原体，脆弱拟杆菌紧随其后。20世纪70年代以来其他多项研究(见下文)表明，如果检验方法得当，厌氧菌的检出率很高。这使得临床上专门针对厌氧菌的药物得到广泛使用，其中最常用的两种是克林霉素和甲硝唑。20世纪70年代对厌氧菌和厌氧菌感染的广泛宣传，使人们普遍认可厌氧菌是某些感染的主要病原体，随之开展了许多大型多中心临床试验、抗生素药敏试验研究，覆盖厌氧菌的抗生素也被广泛使用。这一成功的宣教促使厌氧菌感染率降低，其结果是厌氧菌菌血症近乎消失，一些官方机构建议中止常规厌氧菌血培养。但随后，厌氧菌感染和厌氧菌对常用抗生素耐药的情况均增加。20世纪70年代的“厌氧潮”在识别厌氧菌及其在特定感染中的作用方面极为有效，从而促进了厌氧微生物学检查的普及和抗生素的合理应用。不过，目前担心有些厌氧菌感染无法被检出，部分原因在于微生物学实验室的质量下降，这反映了经济现况、外包，以及对经验性抗生素的依赖。可能最为重要的是，厌氧菌培养要求有高水平的微生物学专业技术，才能分离和鉴定感染部位众多不同的微生物，且厌氧菌培养通常要在做出治疗决策后才能出结果。大部分情况下，根据感染部位、治疗性试验的结果和革兰染色结果判断出可能的病原体后，给予经验性治疗。需注意，厌氧菌感染率在不断攀升，这很有可能是因为有复杂基础疾病的患者数量增加。例如，梅奥诊所的一份报告显示：从1974-1988年，厌氧菌菌血症的发病率下降，随后增加到1993-1996年的平均53例/年，而后又增加至2001-2004年的平均94例/年。由于厌氧菌对抗生素(包括莫西沙星、头孢西丁、碳青霉烯类和克林霉素)的耐药性不断增加，该问题在厌氧菌感染的识别和抗生素的选择方面日益重要。正常菌群人体大部分皮肤黏膜表面寄居着由需氧菌和厌氧菌组成的丰富的固有菌群，不同解剖部位的微生物种类及浓度不同(表 1)。厌氧菌是优势菌，通常占可培养菌群的99%-99.9%。正常人的细菌种类总数很可能超过500种，仅结肠就有500-1000种/人。但一般来说，正常菌群大都不能通过当前实验室方法培养生长或鉴定。例如，一项分析纳入了来自结肠的13,555个原核生物rRNA基因序列，其中大部分细菌为未经培养的新型微生物。不过，利用扩展方法提高了对更多的人体厌氧菌和需养菌的培养成功率上气道包括口腔、鼻道、口咽和鼻咽，寄居着复杂的菌群，虽然其解剖结构连续，但不同部位的菌群不同，称为生态位。唾液中的细菌浓度约为108/mL，厌氧菌占90%，其中主要是小韦荣氏球菌(Veillonella parvula)。牙菌斑包含复杂的细菌，例如，龋齿的主要致病菌变异链球菌(Streptococcus mutans)，但也有厌氧菌。龈沟的环境特点类似于结肠：氧化还原电位为-300mV，细菌浓度达1012/mL(细菌生长的最大密度)，厌氧细菌占可培养菌群的99%。健康人的鼻窦、咽鼓管和喉以下的呼吸道通常无菌。

上气道最重要的潜在厌氧病原体有具核梭杆菌、黑色素普氏菌、口腔普氏菌(Prevotella oralis)、解脲拟杆菌(Bacteroides ureolyticus)和消化链球菌(Peptostreptococcus)，是口腔和胸膜肺厌氧菌感染的主要病原体。研究发现，Lemierre病的致病菌坏死梭杆菌(Fusobacterium necrophorum)可能是咽炎的重要病因。胃肠道不同水平的细菌浓度有显著差异。胃受胃酸屏障保护，因此含菌量较少，基本为吞咽入唾液细菌，主要为革兰阳性菌。随着胃液酸度的降低，细菌数量和种类增加。小肠是快速运动的部位，故此处常见的微生物只是“过路菌”。这种流动中断，例如出现停滞肠段(狭窄、梗阻、憩室或盲袢)，将导致小肠内出现结肠浓度的细菌，并以厌氧菌为主。这种细菌过度生长可能导致吸收不良，最好采用针对厌氧菌的抗生素治疗。有人推测，细菌过度生长可能参与了肠易激综合征的发生。相对停滞的回肠末端和结肠中厌氧菌浓度最高，达1011/g，约占可培养菌群的99.9%。最重要且最常见的厌氧菌包括拟杆菌(Bacteroides；主要是脆弱拟杆菌)、普氏菌(Prevotella)、梭菌(Clostridium)和消化链球菌。用16S rRNA基因测序检测细菌发现有明显的个体差异，受饮食和药物的影响很大，受宿主基因组成的影响较小。这些统称为“胃肠道微生物组”，但还需要采用其他基因组方法来检测病毒、真菌和寄生虫。动物研究发现，该微生物组可能在肥胖、糖尿病、代谢综合征等重要疾病中发挥作用。结肠菌群是在断奶后建立的，人们认为，如果饮食及其他环境影响因素保持稳定，结肠菌群将终生维持相对稳定，除非遭到抗生素治疗的破坏。其维护健康的作用应该是通过防止外源微生物定植而建立生态平衡。这种保护称为“定植抗力”，会遭到抗生素治疗破坏，从而增加肠道病原体感染和耐药细菌(如，耐万古霉素肠球菌和耐药性革兰阴性杆菌)定植的可能。这些细菌会导致多种医院感染，包括中性粒细胞减少或危重病患者的严重感染。该理论合理延伸是“粪便菌群的选择性调节”，即使用抗需氧革兰阴性杆菌但保留厌氧菌的抗生素，以防耐药菌株定植，其目的旨在预防危重患者发生医院内肺炎、菌血症和其他严重感染。大部分数据来自对结肠菌群选择性杀灭以预防医院内或呼吸机相关肺炎的研究。这些研究普遍表明，医院内肺炎的发生率降低很显著，但死亡率未降低。结肠细菌的另一重要作用是预防两种抗生素相关性腹泻。最常见的是艰难梭菌(Clostridioides difficile)相关腹泻或结肠炎，这是由毒素介导的，且可能致命；据推测，抗生素消灭了结肠菌群中与艰难梭菌竞争的关键成分后，结肠中的艰难梭菌孢子会变为可产生毒素的繁殖体，从而发生该病。另一种抗生素相关腹泻可能是由于消除了结肠厌氧菌，这些厌氧菌对代谢碳水化合物以产生可被结肠吸收的短链脂肪酸至关重要。由于消除了关键的厌氧菌，尤其是梭状芽胞杆菌、拟杆菌和双歧杆菌(Bifidobacteria)，结肠无法处理碳水化合物，从而导致渗透性腹泻，而停用抗生素后会迅速缓解。女性生殖道菌群的稳定性不如胃肠道。在育龄期，阴道或宫颈的平均细菌浓度约为108/mL，但不同研究中差异较大(105-1011/mL)，可能是技术原因，也可能确实存在差异。宫颈和阴道标本同时培养显示出独特的细菌学模式，而序贯培养则显示在月经周期的不同阶段有明显变化，可能是受激素影响。约50%是厌氧菌，但可能有所差异。约有20%的女性检测不到厌氧菌，或至少为低浓度。主要的微生物是需氧、微需氧和厌氧乳酸杆菌，最常见的厌氧菌是乳杆菌(Lactobacillus)、消化链球菌和拟杆菌，包括二路普氏菌(Prevotella bivia)，以前称为二路拟杆菌(Bacteroides bivius)。脆弱拟杆菌只占2%-10%。可能影响生殖道细菌学表现的因素包括：月经初潮，绝经，妊娠，抗生素治疗，妇科手术。尚未充分研究生殖道菌群在维持稳态中的作用，但抗生素治疗明显容易诱发阴道假丝酵母菌病。细菌性阴道病(bacterial vaginosis, BV)可能反映了生殖道菌群的微生态失调：乳酸杆菌(可能有助于维持稳态)的浓度明显降低。革兰染色和培养显示，主要微生物是厌氧菌。阴道流出物以厌氧菌产生的短链挥发性脂肪酸为主。BV当前的治疗推荐仅限于针对厌氧菌的药物(甲硝唑和克林霉素)。皮肤菌群包含大量厌氧菌，主要的微生物有痤疮丙酸杆菌(Cutibacterium acnes，以前称为Propionibacterium acnes)，还有其他丙酸杆菌(Cutibacterium)和消化链球菌。微生物组近年来，有重要临床应用的厌氧菌临床和实验室研究获得的新进展相对较少。不过，与之密切相关的微生物组研究逐渐具备了以新的方式影响医学的巨大潜能。该研究领域较新，但发展迅速，其依据的一项多中心分析使用分子学方法(16S核糖体分析)在300人的15个解剖部位中确定了独特的微生物组。宏基因组学(“鸟枪法”测序)、RNA测序、蛋白质组学和不断发展的计算机工具，使我们能更深入地了解除细菌之外微生物组的其他信息。部分研究内容对标准教学内容提出了质疑，例如，以前人们普遍认为健康人喉部以下的呼吸道是无菌的，但有些研究发现，从鼻孔到肺泡都有微生物连续分布。大多数部位的主要细菌是专性厌氧菌，但要确定其在健康和疾病中的作用，需要采用不同于传统Koch法则感染病模型的方法。这些细菌可能以我们知之甚少的方式沟通，且可能在许多疾病或情况(并非传统上所认为的感染性疾病)中发挥重要作用，包括心血管疾病、糖尿病、精神科和神经系统疾病、哮喘、肥胖、代谢综合征、癌症、炎症性肠病，甚至是药物的疗效和疫苗效力。最终目的是能够利用这些信息促进健康，就像抗生素和益生菌那样。这项工作还处于早期阶段。不过，这些早期研究确定了抗生素滥用的后果，有证据表明，某些胃肠道细菌来源的代谢物可能影响人类心血管疾病的结局。因此，对正常菌群、厌氧菌和协同作用的研究，最终为人们了解病理生理学和疾病防治提供了新的思路。这些研究资料具有明确价值的唯一实际应用是使用粪便菌群移植(fecal microbiota transplantation, FMT)治疗复发性艰难梭菌结肠炎。目前正在评估FMT用于其他疾病的情况，例如炎症性肠病、肠易激综合征、根除耐药细菌，以及对癌症治疗的影响，尤其是免疫治疗。仍要关注移植微生物组负面影响，如肥胖、糖尿病和代谢综合征。

总结

厌氧菌是人体内主要的微生物。虽然早在20世纪初人们就知晓厌氧菌具有致病作用，但厌氧菌常常被忽视，部分原因在于极少有临床实验室能可靠地检测厌氧菌。近几十年来，人们通过从感染部位检出厌氧菌、应用抗生素治疗有效以及对致病因子的阐明，证明厌氧菌具有致病作用，因而对厌氧菌感染重新燃起兴趣。当今时代，人们通常假定存在厌氧菌，并且应用特效抗生素进行针对厌氧菌的治疗。厌氧菌是指在缺氧条件下生长，且不能在空气二氧化碳浓度为10%时表面生长的细菌，根据其对氧气的耐受程度可进一步分类：严格厌氧菌只能耐受＜0.5%的氧气；临床上重要的厌氧菌大多是能耐受2%-8%氧气的中度厌氧菌，包括脆弱拟杆菌、黑色素普氏菌(以前归为产黑色素拟杆菌)和具核梭杆菌。目前担心有些厌氧菌感染不能被检出，部分原因在于微生物学实验室中合适检测的减少，这反映了经济现实、外包，以及对经验性抗生素的依赖。此外，厌氧菌感染率似乎在不断攀升，这很有可能是因为有复杂基础疾病的患者数量增加。人体大部分皮肤黏膜表面寄居着由需氧菌和厌氧菌组成的丰富的固有菌群，不同解剖部位的微生物种类及浓度不同(表 1)。厌氧菌占优势，通常占可培养菌群的99%-99.9%。上气道包括口腔、鼻道、口咽和鼻咽，寄居着复杂的菌群，虽然其解剖结构连续，但不同部位的菌群不同。上气道最重要的潜在厌氧病原体为核梭杆菌、黑色素普氏菌、口腔普氏菌、解脲拟杆菌和消化链球菌，是口腔和胸膜肺厌氧菌感染主要的病原体。胃肠道不同水平的细菌浓度有显著差异。胃受胃酸屏障保护，因此含菌量较少，基本为吞咽入的唾液细菌，主要为革兰阳性菌。小肠是快速运动的部位，故此处常见的微生物只是“过路菌”。这种流动中断，例如出现停滞肠段(狭窄、梗阻、憩室或盲袢)，将导致小肠内出现如结肠浓度的细菌，以厌氧菌为主。相对停滞的回肠末端和结肠中厌氧菌浓度最高，达1011/g，约占可培养菌群的99.9%。最重要且最常见的厌氧菌是拟杆菌(主要为脆弱拟杆菌)、普氏菌、梭菌和消化链球菌。女性生殖道主要的微生物是需氧、微需氧和厌氧乳酸杆菌，最常见的厌氧菌是乳杆菌、消化链球菌，以及拟杆菌，包括二路普氏菌(旧称二路拟杆菌)。皮肤菌群包含大量厌氧菌，主要的微生物有痤疮丙酸杆菌，还有其他丙酸杆菌和消化链球菌。近年来，有重要临床应用的厌氧菌临床和实验室研究获得的新进展相对较少。不过，与之密切相关的微生物组研究逐渐具备了以新的方式影响医学的巨大潜能。迄今为止这些研究资料具有明确价值的唯一实际应用是使用粪便菌群移植(FMT)治疗复发性艰难梭菌结肠炎。

--Nat Med. 2019 Mar;25(3):358. doi: 10.1038/s41591-019-0396-4.

---JAMA. 2015 May 5;313(17):1699-701. doi: 10.1001/jama.2015.2159.