中国药科大学尤启冬团队 | 百花齐放：多种异双功降解剂大放异彩

导读

异双功能分子通过linker同时与内源性效应物和感兴趣的靶蛋白（POI） 结合，通过使两种蛋白质互相接近发挥作用。越来越多的异双功能分子被设计用于靶向和影响无法成药的靶点或扩大目前使用的药物的治疗潜力。在这些异双功能分子中，PROTAC是最受认可和最成功的治疗方法之一。

虽然 PROTAC 为小分子药物设计开辟了一条新途径，但它们并不适用于所有蛋白，因为泛素蛋白酶体系统 (UPS）仅限于细胞质和细胞核。一些膜蛋白，例如具有复杂膜嵌入拓扑结构且缺乏胞内配体结构域的多次跨膜蛋白，不适合 PROTACs 靶向。随着时间的推移，除了 UPS，自噬机制、内体/溶酶体、磷酸化途径和核糖核酸酶 (RNase) L被发现可降解靶标或调节翻译后修饰 (PTMs)，使这些细胞系统的组件成为设计异双功能的潜在效应器分子。通过邻近策略的效应子募集，异双功能分子可以应用于越来越多的领域，从而为未来的治疗药物发现提供替代选择。

作者 | 阿卜

图1 药物发现中使用的异功能分子的演变时间轴

2022年6月10日，中国药科大学药学院尤启冬团队在Journal of Medicine Chemistry期刊发表了题为Beyond Proteolysis-Targeting Chimeric Molecules: Designing Heterobifunctional Molecules Based on Functional Effectors的综述论文，详细介绍了除 PROTACs 之外的异双功能分子，总结了现有分子的局限性，列出了主要挑战，并提出了未来研究方向的观点，为基于底物邻近靶向的替代设计策略提供了见解。

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jmedchem.2c00316

异质功能分子设计的合理策略

近年来，选择性降解疾病相关蛋白的已被视为一种替代的和新颖的治疗策略。通常，异双功能分子由两个分子组成，它们分别与靶标和效应子结合，并通过linker连接。因此，异双功能分子具有两个结合界面和不同的linker，可调节效应物和靶标之间的距离和相互作用。有效的 POI 和效应物结合剂是理想的选择，有助于提高异双功能分子的选择性和效率。考虑到可以触发的不同机制，异双功能分子可用于治疗传统小分子难以调节功能的难治性靶标这种催化机制和诱导的蛋白质邻近性赋予了杂双功能分子以高选择性和高效率来调节靶向作用。

传统的小分子分子量（MW）不超过 500 Da，而异双功能分子的分子量（MW）相对较大，因此人们担心异双功能分子是否表现出药物样特性，最近的药物化学策略，例如优化linker和结构,正在实施以赋予异双功能分子更好的细胞渗透性、耐药药代动力学特性和降低免疫原性。然而，异双功能分子的一些关键问题仍有待解决，包括钩子效应、三元配合物的机制、可控性、稳定性和脱靶效应。在未来几年，优化异双功能分子以克服成药性挑战可能是一项重大的研究任务。然而，通过化学诱导接近 (CIP) 技术，已经设计出越来越多的异双功能分子，这些分子利用各种内源性效应子并可以调节不同靶点的作用。

图2 基于内源效应子的双功能分子诱导降解机制概述

通过招募内源性效应子

设计的异双功能分子

溶酶体招募异双功能分子——LYTACs

除了蛋白酶体，内体/溶酶体途径是一个重要的蛋白质降解平台。溶酶体是膜结合的细胞器，储存消化酶，可分解多种生物分子。被特定生物标志物自然内吞的材料被 LTR 掺入，然后由早期内体、内体载体囊泡、晚期内体和溶酶体依次加工，并在其中水解。在天然溶酶体降解机制的基础上，将LTR配体与POI结合分子连接，设计出LYTACs。理想情况下，LYTACs可以通过连接POI和LTR来利用溶酶体的作用，诱导溶酶体介导的降解。2020年，Carolyn R. Bertozzi教授的研究团队在《自然》杂志上发表了突破性研究进展。介绍了第一代 LYTAC，即 M6Pn-LYTAC，是通过将靶向 POI 的抗体或小分子与 6-磷酸甘露糖 (M6P) 修饰（这对于与 CI-M6PR 结合至关重要）连接而产生的。LYTACs的提出补充了PROTACs的功能，解决了细胞外和膜相关POI不能被PROTACs靶向的问题。综述作者表示，LYTACs可被开发为针对与细胞外和膜相关的POI有关的疾病的药物，如G蛋白偶联受体和离子通道。

图3 LYTACs的作用机理及代表性化合物

自噬招募的异双功能分子——AUTACs

自噬系统在溶酶体介导的细胞内物质降解中起主要作用，导致广泛的底物降解，例如受损的细胞器、聚集的蛋白质和细胞内碎片，它们不在蛋白酶体途径中。常规自噬是维持细胞稳态所必需的，而异常的自噬与癌症、肺部疾病和神经退行性疾病等病理状态有关。

因此，自噬的人工调节被认为是一种有前途的治疗方法。在第一代 AUTAC 中，选择鸟嘌呤衍生物 (cGMP) 作为自噬标签来诱导内源性 S-鸟苷酸化。在用 cGMP-HTL 处理的细胞中，EGFP-HT（POI）的水平降低，这证明了 AUTAC 的可行性。随着 AUTAC 的可行性得到验证，它们还具有选择性降解新型聚集蛋白的令人兴奋的潜力，这些蛋白的功能仍有待在疾病中得到验证。

综述作者表示，AUTACs 的发展仍然面临许多挑战。例如，AUTACs 的效率仍然需要提高，因为 AUTACs 降解 POI 比 PROTACs 等其他嵌合体需要更多的时间。AUTACs对体内整体自噬过程的影响还有待探索。最后，自噬的一些关键机制尚不清楚，这使得难以阐明 AUTACs 的确切机制和扩展 AUTAC平台以利用其他介导自噬的标签或受体。未来应关注探索自噬的基本机制，产生更多参与自噬流动的关键分子的配体，这可以极大地扩展AUTACs的平台。

图4 AUTACs的作用机理及代表性化合物

核糖核酸酶招募异双功能分子

RIBOTACs 异双功能分子，它由 RNA 靶向配体、RNase 招募部分和两个部分之间的linker组成。RIBOTACs 通过将内源性 RNase 招募到特定 RNA、激活 RNase 并诱导靶 RNA 的选择性切割来发挥作用。合成的短 2’-5’ A4寡核苷酸已被用作 RNase L 招募剂以产生化合物2, 这是第一个 RIBOTAC由Costales 等人设计。综述作者表示，RIBOTACs 的优化还需要更多的努力。与其他异双功能分子类似，中等大小分子相对较低的渗透性在临床试验中可能是一个巨大的挑战。此外，高选择性的RNA小分子配体设计难度大，而缺乏选择性的配体最容易造成脱靶效应。未来，随着 生物和计算方法的发展，更多具有高亲和力和选择性的 RNA 和 RNase L 小分子配体将进一步推动RIBOTAC的应用及其临床转化。

图5 RIBOTACs的作用机理及代表性化合物

蛋白磷酸酶招募异双功能分子PHORCs/PhosTACs

磷酸化和去磷酸化是最重要的 PTM之一，因为它们参与调节多种生物学功能，包括 DNA 复制、细胞周期进程、能量代谢以及细胞分化和发育。2019年，招募磷酸酶的异双功能分子的研究首次发表，Yamazoe研究团队利用双功能分子，将PP1磷酸酶招募到到AKT和EGFR附近并且导致靶点蛋白的去磷酸化。基于这一发现，PROTAC研究的先驱之一，耶鲁大学Craig M. Crews教授的课题组开发了名为磷酸化靶向嵌合体（PhosTACs）的分子。它们能够招募丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2A（PP2A），对PDCD4蛋白和FOXO3a蛋白进行去磷酸化。综述作者表明，PHORCs已成为通过改变POI的磷酸化状态而不是其表达水平来精确调节POI功能的有效工具，这可能会防止因不希望的PROTAC诱导的蛋白质降解而可能产生的副作用。理想情况下，PHORCs可以保留PROTACs的一些优点，如克服耐药性和不可药性，提高特异性和减少毒性。因此，PHORCs可以应用于PTMs的生物学研究和治疗由异常的高磷酸化目标引起的疾病。然而，在PHORCs的发展过程中仍有许多问题需要解决。首先，PHORCs的一些机制仍需精确阐明。此外，实现功能上有用的磷酸化事件比实现功能上有用的降解要难得多，这在传统的PROTACs中可以看到。而且，蛋白磷酸酶配体的相对短缺，特别是那些没有抑制作用的配体，是产生和优化PHORCs的一个主要障碍。最后，需要考虑PHORCs的可药性，这与细胞内渗透性差和在细胞水解酶存在下的不稳定性有关。

图6 RCs/PhosTACs的作用机制及代表性化合物 激酶招募异双功能分子——PHICS

2020年，PHICS被认为是一种由激酶激活剂、POI结合剂和linker组成的异双功能分子，它通过诱导底物的易位使其接近而招募激酶来磷酸化POI。PHICS1 (20) 和 PHICS2 (21) 是第一个设计的 PHICS，它们分别使用内源性丝氨酸/苏氨酸激酶 AMPK 和 PKC 来磷酸化 BRD4。在激酶募集机制的基础上，PHICS 可以成为调节 POI 磷酸化状态的有效工具，它保留了双功能分子的一些优点，如异构体特异性、高选择性和快速动力学。综述作者认为，与目标蛋白降解相比，只有少数 PHICS 被开发用于概念验证。它们在体内的功效和成药性仍有待验证。此外，配体的亲和力与分子效率之间的关系尚不清楚。PROTAC 通常需要具有合适亲和力（通常在 1 到 500 nM 之间）的配体，这对于其他异双功能分子也可能很重要。但由于缺乏探索和案例，目前无法预测PHORCs/PHICS的宝贵数据。为了促进 PHICS 的发展，需要做出更多的努力来扩展和修改它们。

图7 HICS的作用机理及代表性化合物

乙酰转移酶招募异双功能分子——AceTAGs

赖氨酸乙酰化是最常见的PTM之一，发生在人类蛋白质上超过10000个位点，参与许多关键的细胞过程，如基因转录、DNA损伤修复、信号转导和蛋白质折叠。第一个 AceTAG 使用了与 FKBP12 结合配体连接的 KAT 抑制剂。这些异双功能分子调节了内源性 KAT 和 FKBP12标记的 POI 之间的距离，从而诱导了基于底物接近的乙酰化。综述作者指出，AceTAG 技术导致了由小分子介导的底物特异性乙酰化。它们的小分子特性，如快速和可逆的功能、高效和选择性，可以提供高效和精确的乙酰化调节剂的空白。然而，优化 AceTAGs 仍有许多工作要做，包括更多研究不同linker的目标偏好和监测乙酰化的富集方法。此外，AceTAGs 是否可以在数千个乙酰化位点诱导位点选择性乙酰化也需要进一步探索。此外，未来应关注 KAT 招募的异双功能分子的普遍性，特别是它们招募其他 KAT 和调节其他 POI 的能力，包括标记的蛋白质和天然蛋白质。这些进展需要更多的 KAT 和 POI 配体。

图8 AceTAGs的作用机理及代表性化合物

总结

综述作者表示，异双功能分子通过有目的地招募效应子和 POI 丰富了合理药物设计的概念，并可能引发未来药物发现的革命，特别是小分子药物的发现。此外，异双功能分子可作为生物学研究的有效工具。但也充满挑战。在作者看来，未来对异双功能分子的研究将主要集中在以下几点：

首先，需要更深入的机制研究，包括嵌合分子对POI 的特异性以及嵌合分子诱导的三元复合物形成的动力学。此外，三元复合物（效应子、POI和嵌合分子之间）形成过程中的动力学机制仍然未知。例如，三元复合物的形成是否有先后顺序？阐明这些动力学机制将指导更有效的异双功能分子的设计。

其次，需要通过开发高亲和力和选择性配体来增加异双功能分子的活性。目前，由于发现的配体数量有限，选择了一些结合亲和力低的配体（甚至是抑制剂）作为结合剂来招募效应子，这大大降低了异双功能分子的效率。

第三，这些异双功能分子的成药性是另一个重要的研究方向。大多数已知的异双功能分子因其大分子量（超过 Lipinski 的五法则）而表现出较差的 PK 曲线、溶解度和细胞渗透性。因此，通过结构优化来改善这些特性对于异双功能分子的临床推进具有重要价值。最后，从长远来看，仍将大量努力开发可招募更多内源性效应子的异双功能分子，这将进一步丰富靶点调节的内容，异双功能分子将代表新药发现发展的里程碑。

图9双功能分子的研究进展

参考文献： Hua L, Zhang Q, Zhu X, Wang R, You Q, Wang L. Beyond Proteolysis-Targeting Chimeric Molecules: Designing Heterobifunctional Molecules Based on Functional Effectors. J Med Chem. 2022 Jun 23;65(12):8091-8112. doi: 10.1021/acs.jmedchem.2c00316. Epub 2022 Jun 10. PMID: 35686733.

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