精准前沿丨单细胞联合空间转录组技术揭示结直肠癌FAP+成纤维细胞与SPP1+巨噬细胞的互作模式

本期《精准前沿》栏目分享上海交通大学医学院上海市免疫学研究所苏冰教授团队和叶幼琼研究员团队发表于Nature Communications（IF =17.694）上的一篇研究[1]，本文利用单细胞转录组、空间转录组、免疫荧光成像等技术手段对结直肠癌的肿瘤微环境进行深入研究，并探索肿瘤微环境在结直肠癌免疫治疗中的抑制作用。研究结果提示，破坏FAP+成纤维细胞与SPP1+巨噬细胞间的互作或可改善免疫治疗疗效。

研究背景

结直肠癌（colorectal cancer, CRC）是继肺癌和乳腺癌后的第三大常见恶性肿瘤，每年在全世界造成约800,000人死亡。目前，免疫检查点阻断（immune checkpoint blockade, ICB）策略已应用于CRC治疗，然而靶向PD-1的pembrolizumab（派姆单抗）仅对高度微卫星不稳定（high microsatellite instability, MSI-H）的错配修复缺陷肿瘤有效，该类型肿瘤占转移性CRC病例的比例<5%。因此，有必要了解CRC肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）中细胞和分子的重塑机制，寻找潜在的干预靶点以提高免疫治疗的疗效。

研究设计

1. 入组样本信息：5例非转移性CRC患者，其中2例为结肠腺癌（colonic adenocarcinoma, COAD），3例为直肠腺癌（rectal adenocarcinoma, READ）;

2. 手术获取5例非转移性CRC患者的肿瘤组织和邻近正常组织，进行单细胞转录组测序（10× Genomics）；

3. 取上述5例中的4例CRC患者肿瘤组织切片进行空间转录组测序；

4. 文章使用的公共数据库信息：TCGA-COAD和READ队列RNA-seq数据、GEO数据库中12个独立的CRC队列RNA-seq数据以及IMvigor210公共数据集。

本文研究设计概览图

研究结果

1. CRC患者的肿瘤组织和配对的邻近正常组织的单细胞转录组图谱

将手术获取的5例CRC患者的肿瘤组织及配对的邻近正常组织进行单细胞转录组测序，质控后共获得54,103个细胞的转录组数据用于后续分析（其中包括29,481个正常细胞，24,622个肿瘤细胞）。聚类分析注释将这些细胞划分为九种主要的细胞类型（图1b-d），分别为上皮细胞（表达EPCAM和CDH1）、T/ILC细胞（表达CD3E和CD3G）、B细胞（表达MS4A1和CD79A）、浆细胞（表达SDC1和MZB1）、髓样细胞（表达CD14和FCGR3A）、肥大细胞（表达KIT、IL1RL1和MS4A2）、内皮细胞（表达PECAM1和CDH5）、间充质基质细胞（表达COL1A1和COL3A1）及神经胶质细胞（表达S100B和CDH2）。虽然肿瘤组织和邻近正常组织都具有这九种细胞类型（图1e）,但每种细胞的浸润程度不同，可能反应了CRC进展阶段的差异。

图1. 单细胞转录组图谱及细胞类型注释

2. CRC患者肿瘤组织的细胞亚群特征揭示TME的标志特征和临床结局的预测

为了研究肿瘤浸润细胞亚群调控网络的变化，本文利用Molecular Signatures Database（MsigDB）的hallmark基因集分析相邻正常组织和肿瘤组织间MSC、EC、神经胶质细胞、髓样细胞、T细胞和B细胞通路的变化（图2a）。与正常组织相比，肿瘤组织中包括炎症反应、IL2/STAT5信号和IL6/JAK/STAT3信号在内的免疫相关途径，不仅在免疫细胞群（如髓样细胞和T/ILC细胞）中富集，而且在MSC和EC中也出现富集，表明MSC和EC也参与抵抗CRC的免疫反应。与正常组织相比，肿瘤的MSC、EC和髓样细胞中缺氧的hallmark基因集更富集（图2a）。这些特征可能反映了肿瘤缺氧区域基质细胞的相互作用，将巨噬细胞、MSC和EC联系起来，重塑CRC微环境。由于本文的scRNA-seq样本量有限，作者还分析了TCGA-COAD、TCGA-READ以及GEO数据库中12个独立CRC队列的RNA-seq数据，使用CIBERSORTx分析免疫细胞的浸润情况，分析结果表明在全部队列中，MSC和髓样细胞间存在显著正相关（图2b、c）。此外，作者还评估了CRC中MSC和髓样细胞的浸润程度与临床结局的相关性（图2d、e）,结果表明MSC浸润程度较高的CRC患者与较差的OS和PFS相关，髓样细胞浸润程度较高的CRC患者与较差的OS和PFS相关。

图2. MSC和髓样细胞在肿瘤浸润中呈正相关，且和临床结局相关

3. 肿瘤特异性FAP+成纤维细胞与CRC进展相关

长期以来，MSC和成纤维样细胞被认为是调控肿瘤发生和癌症进展的关键基质细胞类型。本文利用之前报道的特异性细胞特征marker将MSC分为10个亚型（图3a），与邻近正常组织相比，肿瘤组织中FAP+成纤维细胞、增殖成纤维细胞和周细胞明显富集（图3b、c）。作者又进一步验证TCGA-COAD队列中的CRC患者FAP+成纤维细胞在肿瘤组织中的明显富集（图3d），同时还观察到FAP+成纤维细胞浸润程度较高的CRC患者PFS较短（图3e）。此外，文章通过流式细胞术验证了肿瘤特异性成纤维细胞的浸润（图3f、g），结果表明CRC肿瘤组织中FAP+成纤维细胞浸润显著增加，NT5E+和FGFR2+的浸润显著减少。

随后，作者利用scRNA-seq数据预测FAP+成纤维细胞的分化轨迹，该分析预测肿瘤特异性FAP+成纤维细胞可能来源于FGFR2+成纤维细胞或ICAM1+特络细胞（图3h）。FAP+成纤维细胞的分化是通过复杂的转录因子（transcription factors, TF）网络调控的，作者分别评估了这10种MSC亚型top 5表达的TF以及TF调控网络中top 5活性的调节子（图3i-l），发现TWIST1在FAP+成纤维细胞的调控网络中具有最高的表达和活性水平，并且可能代表驱动该分化途径的主要TF。缺氧是TME最重要的特征之一，之前的研究表明TWIST1可能受缺氧的调控。与其他MSC亚类相比，缺氧依赖的HIF-1α信号途径在FAP+成纤维细胞中显著富集（图3m）。

图3. 正常粘膜和肿瘤组织中基质细胞的特征

4. 肿瘤特异性SPP1+巨噬细胞与CRC进展相关

CRC患者髓样细胞的重塑表明这些细胞在肿瘤发生中具有功能。作者研究了在肿瘤组织和邻近正常组织中髓样细胞亚型的改变（图4a），单细胞注释将髓样细胞分为9种亚类，巨噬细胞和中性粒细胞主要存在于肿瘤组织中，DC在邻近正常组织中富集。重要的是，SPP1+巨噬细胞是肿瘤特异性巨噬细胞，在肿瘤样本中占髓样细胞的11.6%，但在邻近正常组织中只占髓样细胞的0.68%（图4c）。作者又进一步验证TCGA-COAD队列中 SPP1+巨噬细胞 浸润程度较高的CRC患者PFS较短（图4e）。流式分析结果表明SPP1+巨噬细胞在肿瘤组织中的浸润显著增加，THBS1+巨噬细胞无明显变化（图4g）。此外，单细胞 RNA velocity 预测结果表明肿瘤特异性SPP1+巨噬细胞可能起源于THBS1+巨噬细胞（图4h）。

为了进一步确定SPP1+巨噬细胞的主要调控因子，作者进行pySCENIC分析，结果表明编码使小鼠巨噬细胞向M1表型极化的主转录因子STAT1在SPP1+巨噬细胞中高度活跃（图4i-l）。由于FAP+成纤维细胞和SPP1+巨噬细胞密切参与缺氧诱导途径，作者推测在肿瘤的缺氧区域存在基质细胞介导的网络，该网络连接巨噬细胞和MSC，共同促进CRC微环境的恶化。

图4. 正常粘膜和肿瘤组织中髓样细胞的特征

5. FAP+成纤维细胞和SPP1+巨噬细胞的高度浸润与较差的患者生存率相关

作者使用CIBERSORTx评估了由scRNA-seq鉴定的50个细胞亚群在14个独立的CRC队列中的浸润状况（图5a），发现FAP+成纤维细胞和SPP1+巨噬细胞的相关性最高。为了进一步揭示这两种细胞类型之间密切相关的临床意义，作者比较了不同水平FAP+成纤维细胞和SPP1+巨噬细胞的患者的PFS。FAP+成纤维细胞和SPP1+巨噬细胞均高度浸润的患者的PFS最短，表明这两种细胞类型可以协同促进肿瘤进展（图5b）。对TCGA-COAD队列的GSEA分析表明，FAP+成纤维细胞和SPP1+巨噬细胞均高度浸润的肿瘤样本中上皮-间充质转化特征和缺氧基因集高度富集（图5c），TNFα和IL2/STAT5信号通路也出现富集。这些发现表明FAP+成纤维细胞和SPP1+巨噬细胞对CRC TME中不同的刺激和信号作出反应。随后，作者通过对78例CRC患者组织芯片（TMA）的H-score系统评估蛋白表达水平，与邻近正常组织相比，肿瘤组织中FAP和SPP1均增加（图5d，e），FAP或SPP1蛋白表达水平高的患者OS较短（图5f，g）。此外，FAP和SPP1表达水平均高的患者的存活率较低（图5h）。免疫荧光标记表明CRC组织中SPP1阳性和FAP阳性的细胞空间距离非常接近（图5I，j），这意味着这两种细胞之间存在潜在的串扰。

图5. FAP+成纤维细胞和SPP1+巨噬细胞的高度浸润与较差的患者生存率以及免疫治疗耐药相关

6. 空间转录组学揭示FAP+成纤维细胞和SPP1+巨噬细胞的细胞-细胞相互作用

利用空间转录组技术对FAP+成纤维细胞和SPP1+巨噬细胞的空间组成进行更深入的评估（图6a-f），结果显示FAP+成纤维细胞和SPP1+巨噬细胞共定位并包裹恶性上皮细胞（图6g-i），FAP+成纤维细胞或SPP1+巨噬细胞的特征评分呈显著正相关（图6j、k）。此外，作者发现4例空间转录组数据集的FAP+成纤维细胞和SPP1+巨噬细胞结缔组织增生结构形成相关的途径高度活跃，包括细胞外基质组织、胶原纤维组织和对TGF-β的反应（图6l），T细胞和B细胞被排除在肿瘤区域外（图6m）。这些结果表明，促结缔组织增生的微环境可能受到FAP+成纤维细胞和SPP1+巨噬细胞的互作调控，限制免疫细胞对肿瘤核心的浸润。

图6. 空间转录组学揭示FAP+成纤维细胞和SPP1+巨噬细胞的共定位

7. FAP+成纤维细胞和SPP1+巨噬细胞的相互作用可能有助于促结缔组织增生肿瘤微环境的形成

使用R包“NicheNet”对FAP+成纤维细胞和SPP1+巨噬细胞的细胞-细胞间通讯机制进行研究，作者发现FAP+成纤维细胞通过粘附配体受体对COL1A1/LAMA1-ITGB1与SPP1+巨噬细胞直接联系（图7a）。此外，FAP+成纤维细胞通过表达TGF-β超家族基因、TGFB1和INHBA增强SPP1+巨噬细胞的促炎活性，TGF-β诱导SPP1+巨噬细胞中ACVRL1、ACVR1或ACVR1B的（图7a）。值得注意的是，FAP+成纤维细胞通过RARRES2-CMKLR1与SPP1+巨噬细胞相互作用（图7a）。作者进一步确定了RARRES2在MSC群的相对表达，并发现该基因在FAP+成纤维细胞的表达水平高于其他MSC亚群（图7b）。由RARRES2编码的趋化素被证明是一个独立的CRC风险因素，在DSS诱导的结肠炎模型中，趋化素能够影响巨噬细胞的极化。编码趋化素受体的基因CMKLR1在THBS1+巨噬细胞和SPP1+巨噬细胞中的表达水平较高（图7c）。之前的RNA velocity预测结果表明肿瘤特异性SPP1+巨噬细胞可能起源于THBS1+巨噬细胞（图4h），FAP+成纤维细胞可作为一个驱动因素，通过趋化素促进SPP1+巨噬细胞的分化。此外，作者发现CRC患者血浆中的趋化素水平显著升高，提示趋化素可作为预测CRC的标志（图7d）。

成纤维细胞是细胞外基质成分的主要生产者，细胞外基质成分可能有助于促结缔组织增生结构的形成。细胞外基质（extracellular matrix, ECM）相关通路的基因在FAP+成纤维细胞和SPP1+巨噬细胞中高表达，表明FAP+成纤维细胞和SPP1+巨噬细胞可能促进促结缔组织增生结构的形成。因此，作者研究了SPP1+巨噬细胞是否促进FAP+成纤维细胞的ECM重塑能力。NicheNet分析表明，SPP1+巨噬细胞表现出较高的TGFB1、IL1B和IL1A配体活性，TGFB1、IL1B和IL1A基因表达水平相对较高（图7e，f）。此外，TGFB1编码蛋白与FAP+成纤维细胞上编码TGFBR3、ACVRL1和TGFBR1的受体结合，而编码IL1B或IL1A的配体与FAP+成纤维细胞上编码IL1R1或IL1RAP的受体相互作用（图7g），导致编码胶原或基质金属肽酶的靶基因在这些细胞中表达（图7h）。这些靶点是促结缔组织增生反应的重要组成部分，其中大部分参与ECM通路（图7i, j）。综上所述，研究结果表明FAP+成纤维细胞和SPP1+巨噬细胞形成相互作用网络，支持彼此的维持和功能。这两种细胞类型可能在ECM重塑中发挥重要作用，可能促进TME促结缔组织增生区域的形成。

图7. FAP+成纤维细胞和SPP1+巨噬细胞的互作网络

8. FAP+成纤维细胞和SPP1+巨噬细胞的高度浸润与免疫治疗耐药相关

作者对FAP+成纤维细胞和/或SPP1+巨噬细胞不同浸润模式的局部免疫特征进行分析，FAP+成纤维细胞和SPP1+巨噬细胞浸润程度高的肿瘤样本表现出相对较高频率的非沉默率突变和单核苷酸变异（SNV）预测的新抗原。此外，也表现出较高的香农熵指数和TCR丰富度，反映了T细胞对新抗原的无效反应（图8a-d）。这种亚型的CRC淋巴细胞浸润程度最低（图8e），表明该类型的CRC微环境特征是免疫排斥型的。使用IMvigor210公共数据集对经抗PD-L1治疗的膀胱癌患者的生存时间与FAP或SPP1表达进行相关性分析，PD-L1抗体治疗后，FAP或SPP1表达水平较高的患者OS较短（图8f, g），FAP和SPP1表达水平均较高的抗PD-L1治疗患者OS较短（图8h）。FAP或SPP1表达水平较高的患者表现出较低的应答和更多的疾病进展（progressive disease, PD），提示FAP或SPP1高表达的患者对抗PD-L1治疗的应答明显低于其他患者。

图8. FAP+成纤维细胞和SPP1+巨噬细胞影响TME中淋巴细胞的浸润和患者对PD-L1阻断剂的反应

结语

通过对本研究sc-RNA-seq数据、公开发表的sc-RNA-seq和bulk RNA-seq数据集、空间转录组数据、FACS、IF和ICB治疗转录组数据的分析，本文描绘了TME及其邻近正常组织在单细胞分辨率水平的景观图，证明FAP+成纤维细胞与SPP1+巨噬细胞间的相互作用可能在促结缔组织增生TME的形成中起指导作用，这可能导致肿瘤免疫治疗的耐药性。在机制上，作者推测FAP+成纤维细胞受缺氧诱导表达的TWIST1基因调控；同时还会分泌趋化素，趋化素进入血管并与THBS1+巨噬细胞结合，后者可能分化为SPP1+巨噬细胞。此外，SPP1+巨噬细胞可能通过TGFB1调控FAP+成纤维细胞，从而促进MMP和胶原的分泌，共同参与ECM的重塑。

参考文献：

[1]  Qi J, Sun H, Zhang Y, et al. Single-cell and spatial analysis reveal interaction of FAP+ fibroblasts and SPP1+ macrophages in colorectal cancer[J]. Nature communications, 2022, 13(1): 1-20.

撰写丨wuyan

编辑、排版丨SX

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