PROTAC全方位综述：过去、现在和未来

前言

与传统小分子抑制剂相比，PROTAC具有独特优势，如催化性质，减少给药剂量和频率，更有效和更持久的作用，增加的选择性以降低潜在毒性，克服耐药性，扩大靶点空间。PROTAC 先驱Craig M. Crews在本篇综述中介绍了该领域重要的里程碑，并简要讨论了近年来有关靶向蛋白质降解（TPD）的经验教训，并推测扩展PROTAC工具箱及提供有前景治疗方法所需的努力。

作者|Ting

背景介绍

疾病相关蛋白的小分子抑制剂(SMI)开发有很多局限性：1缺乏直接调节蛋白质功能的合适的结合袋；2通常需要高的暴露才能达到足够的位点占用导致的脱靶毒性风险；3针对蛋白质的活性位点（如激酶）的选择性差。

针对特定蛋白进行翻译后降解的策略是规避上述缺陷的关键。大多数蛋白质通过泛素-蛋白酶体系统(UPS)进行降解，其中蛋白质首先被泛素共价标记，然后送到26S蛋白酶体进行降解。PROTAC技术利用UPS来降解特定的蛋白质(POI)（图1）。

图1 PROTAC劫持UPS以诱导靶向蛋白质降解

过去

1.1   基于肽的PROTACs  

2001年，我们和Deshaies实验室报告了第一个双功能分子，被称为PROTACs（蛋白质降解靶向嵌合体），促进MetAP-2的泛素化和降解。

肽类PROTACs的第一个改进是利用来自连接酶内源底物缺氧诱导因子1 a（HIF1a）的7个氨基酸识别序列招募von Hippel-Lindau（VHL）E3连接酶。

这些早期肽PROTACs的效力偏低，而且嵌合分子在体内可能被免疫系统识别，产生可能中和降解效应的抗体。因此后续研究集中在开发小分子PROTACs上。

1.2      小分子PROTACs      

我们在2008年首次报道诱导雄激素受体(AR)降解的小分子PROTAC (图2，PROTAC 14)：MDM2-p53蛋白-蛋白相互作用(PPI)抑制剂nutlin-3a为E3配体，选择性AR调节剂(SARM)氟他胺衍生物作为AR配体。

图2 早期小分子PROTACs

2010年，Hashimoto实验室报道了第一个细胞凋亡蛋白1的细胞抑制剂(cIAP1)招募的PROTAC(图2，PROTAC 4a-c)，诱导细胞维甲酸和维甲酸结合蛋白(CRABP-I和II)降解。

2010年，Ito等人确定E3连接酶小脑(CRBN)为配体沙利度胺及其类似物的主要靶点。2014年，Fischer等人报道了这些免疫调节酰亚胺药物(IMiDs)与CRBN结合的结构基础（图3），为IMiDs作为E3招募配体进行PROTAC开发的应用铺平了道路。近年来，一些新底物，如IKZF1、IKZF3、酪蛋白激酶1a(CK1a)、GSPT1和SALL4，已通过IMiD粘合、CRBN介导的泛素化成功降解。

图3 具有代表性的IMiDs和VHL配体

在2012年，我们描述了通过计算机模拟和基于片段筛选设计和合成VHL的第一个小分子配体。随后Ciulli实验室在2014年报道了VHL配体的构效关系(SAR)，确定VHL配体(VH032)改善物理化学性质和一个更高亲和力和特异性的VHL配体(VH298，图3)。基于小分子的VHL E3配体首次被用于成功降解HaloTag7融合蛋白。HaloPROTACs（图2）是当时最有效的PROTACs之一，且已被证明是化学遗传学研究的强大探针。

2015年，我们与GSK合作，发表了第一个基于小分子的VHL招募诱导内源性蛋白质降解的PROTACs(图2，PROTAC_ERRα和PROTAC_RIPK2)。此外，本研究还验证了一个PROTAC分子能够诱导多轮靶蛋白泛素化和降解。且PROTACs在体内降解研究中也发挥作用。

几乎与此同时，Ciulli实验室报道了第一个选择性BRD4 PROTAC，及优化后的PROTAC，MZ1（图2）。

2015年，我们首次报道了一种异双功能PROTAC，ARV-825，将E3泛素连接酶CRBN招募到BRD4，导致其在所有Burkitt淋巴瘤(BL)细胞系中快速、高效和长期降解（图2）。

与此同时，Bradner实验室合成的化合物dBET1（图2）在体内和体外均诱导了高选择性的CRBN依赖的BET蛋白降解。利用同样策略，他们通过将FKBP12导向的配体(SLF)偶联到相同的酞酰亚胺部分来诱导FKBP12降解(图2，dFKBP-1)。

现在

2.1   DC50/Dmax  

当靶向致病蛋白进行降解时，我们的目标是获得高的最大目标降解水平(Dmax)（>90%）和低的半最大值降解浓度(DC50)(nM到pM范围)。用于PROTAC构建的两种配体间的结合亲和力紧密会产生更大的Dmax。通过微调配体的理化性质和连接体的长度、组成和刚性来优化细胞通透性可以改善DC50。

图4 最近的小分子PROTACs

2.2    协同性  

PROTAC诱导稳定的三元配合物的能力比其对POI的亲和力更能预测蛋白质的成功降解。PROTACs可以稳定POI和E3之间的PPIs，促进三元配合物形成的正协同作用。

图5 POI-PROTAC-E3连接酶的代表性三元配合物结构

2.3    钩效应  

饱和剂量的PROTAC分子导致较小的目标蛋白降解现象被称为“钩效应”。钩效应依赖于募集的特定靶点和E3连接酶，以及所利用的不同PROTAC。影响三元配合物形成的变量(如POI浓度、E3连接酶浓度、PROTAC二元结合亲和力和协同性)会影响钩效应。

2.4    催化性质  

PROTACs具有较长的效应持续时间和分化的PK/PD谱。而且使用优化的PROTAC观察到显著的体内效力。

PROTACs的第二个优点是只需要有限的目标接触就可以诱导显著的降解。

2.5    链接学  

连接子的长度和方向可以定义选择性。

连接剂的刚性会影响三元配合物形成的协同性。

晶体学也可以用于调整物理化学性质，如PROTACs的代谢稳定性、膜渗透性和水溶性。

2.6    差异生物学  

事件驱动作用机制（MOA）的PROTAC可以克服抑制剂耐药机制，包括药物靶点的过表达水平和导致耐药的突变，使它们对SMI具有更广泛的生物学适用性。

PROTACs具有控制蛋白质的酶功能和非酶功能的潜力，而这是传统的小分子抑制剂难以解决的。

2.71  

扩大蛋白质降解的目标空间

PROTACs靶向的蛋白包括：蛋白激酶、核受体、表观遗传阅读器、神经退行性疾病相关蛋白、调节蛋白、酶、抗凋亡蛋白、转录因子、支架蛋白、细胞因子、病毒相关蛋白等。

一些蛋白质被称为“不可用药”，原因是（1）平面和无特征的结合位点，（2）缺乏氢键供体和受体，（3）需要适应性构象的变化。PROTACs已经显示出了靶向这些蛋白质进行降解的能力。最近发表的例子如下：

（1）转录因子(TFs)：FOXM1（图12）；β-Catenin；其他针对TFs的基于寡核苷酸的PROTACs：翻译因子靶向嵌合(TRAFTACs)（图13）、TF-PROTAC、基于VHL的TFPROTACs（NF-kB-PROTAC和E2F-PROTAC，图13b）、基于寡核苷酸PROTAC(O’PROTACs)、第二代TRAFTACs（oligoTRAFTACs，图13c）。

图6 基于寡核苷酸的PROTACs

（2）细胞因子：巨噬细胞迁移抑制因子”(MIF)：MD13（图7）。

（3）SF3B1:剪接因子3B亚基1(SF3B1)：PROTAC-O4I2（图7）。

图7 MIF和SF3B1的PROTACs

2.8   临床试验中的降解者  

自Arvinas的第一个小分子靶向蛋白降解剂于2019年开始临床试验以来，近15种PROTAC降解剂已经进入或正在进行临床研究。除了NX-5948和KT-474外，这些项目大多数都是针对癌症的，它们正在用于治疗各种自身免疫性疾病患者的I期临床试验。

2.9   非常规PROTACs和其他TACs  

（1）针对RAS突变体进行降解：使用MRTX849弹头降解内源性KRASG12C的PROTAC，基于单体的PROTAC100，非共价、强效和选择性的KRASG12D小分子抑制剂MRTX1133。

（2）抗体-PROTAC偶联物：抗体-PROTAC和纳米体PROTAC

（3）适配体-PROTAC偶联物

（4）G4-PROTAC

（5）三价PROTACs

图8 三价PROTACs

（6）PROTACs的条件激活：叶酸笼式PROTACs（以减少组织外、靶向毒性），缺氧激活的PROTACs。

（7）其他可诱导靶标降解的TACs/双功能分子：利用溶酶体降解途径建立的新降解技术（LYTAC、AUTAC和ATTEC），通过化学诱导的RNA降解招募核糖核酸酶对抗感兴趣的RNA的策略（RIBOTACs）。

未来

3.1   招募更多的E3连接酶  

改变抑制剂弹头和被招募的E3连接酶决定了哪些蛋白靶点易被诱导降解。

基于靶标的方法，如基于片段的药物设计(FBDD)或E3连接酶与底物蛋白片段肽的共晶结构，是发现E3连接酶配体的主要和富有成效的策略，如cIAP和VHL。

DNA编码文库(DELs)是一种很有吸引力的进行配体发现的组合方法，它允许快速的化学空间的扩展（图9）。

图9 从DEL中发现配体的ERα PROTAC

作为概念验证研究，利用其他可连接解读蛋白：E3连接酶复合物来扩大E3连接酶库将是一种可推广的方法，并在未来实现隔室和疾病特异性蛋白降解。

3.2   缓解细胞渗透性  

简单而直接的策略是提高PROTACs的效力。

还可以通过利用分子内氢键(IMHBs)和氢键供体(HBD)屏蔽来进行微调。

还有一种策略是利用表现出积极合作性的PROTACs，有助于将POI和E3招募到生产接近点，并导致新的PPIs的形成(图10，ARD-266)。

图10 使用具有中等结合亲和力的E3连接酶配体可以获得强有力的PROTAC降解物

3.3   靶向蛋白降解过程中的抗性机制  

肿瘤细胞中长期治疗降解物有抗性，强调了发现不同类型E3连接酶对开发更多不同PROTACs的重要性和紧迫性。在短期内，应采用连续暴露于含有不同E3连接酶或组合策略的降解剂，以减缓耐药性。

3.4    靶向病毒相关蛋白/RNA  

与传统的病毒聚合酶和蛋白酶的酶抑制剂相比，PROTACs最重要的优势是能够克服耐药性。

成功的PROTAC设计可以从“废弃”的靶标结合配体开始完成。

靶向病毒相关蛋白或病毒RNA进行降解，为对抗COVID-19、未来突发的病毒威胁和许多传染病提供了一个多功能和新的治疗平台（图11）。

图11 靶向病毒相关蛋白/RNA

结论

由PROTACs和相关方法诱导的靶向蛋白降解具有独特优势，然而基于该技术的药物开发通常存在低细胞渗透性和口服生物利用度的挑战，且PROTAC介导的细胞活性受多种因素的调节，应继续进行药物化学努力，以改善物理化学性质，推动PROTACs药物研发。

不是所有的靶点都适用于PROTAC介导的降解，因此，验证和过滤程序可以使有效的PROTAC候选药物进行优先排序。靶点降解将为药物发现开辟新的可能性，并提供切实的治疗效益。

参考文献：

Li K, Crews CM. PROTACs: past, present and future. Chem Soc Rev. 2022 Jun 20;51(12):5214-5236. doi: 10.1039/d2cs00193d.

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