CRISPR诞生十周年，Jennifer Doudna解读未来的4个发展方向

撰文丨第九棵橡树 

来源丨金斯瑞生物 

2012年6月28日，Jennifer Doudna、Emmanuelle Charpentier 在国际顶尖学术期刊 Science 上发表了题为：A Programmable Dual-RNA–Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity 的研究论文【1】。  

揭示了 CRISPR/Cas9 的详细作用机制，宣告了一种全新的基因编辑技术的诞生。通过人工设计 crRNA 和 tracrRNA 这两种 RNA ，就可以改造形成具有引导作用的 sgRNA （single guide RNA ），从而引导 Cas9 对 DNA 进行定点切割，为完成特定的基因编辑做准备。 此后10年里，CRISPR/Cas9 一枝独秀，成为公认的最简单高效的基因编辑方式，大大加速了生命科学的研发进程。 波澜壮阔的发展史 CRISPR/Cas9 系统是古细菌和细菌不断进化而来的免疫防御机制。早在1987年，Nakata 课题组就偶然发现，在大肠杆菌基因组上存在着含有29个碱基的高度同源重复性序列，且这些重复序列间存在着含有32个碱基的间隔序列。 

21世纪初，西班牙科学家 Francisco Mojica 正式将这种具有规律性的重复序列命名为 CRISPR （Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats） ，即一种成簇规律间隔的短回文序列，并且在重复序列附近发现了一系列保守的 CRISPR 相关基因 （Cas） 。

此后，一个新术语开始进入了人们的视野。CRISPR 吸引了全球各地的科学家参与研究，其中就包括 Emmanuelle Charpentier 教授和 Jennifer A. Doudna 教授。 2011年，Emmanuelle Charpentier 教授在链球菌中发现，若想要让 CRISPR 系统起作用，不仅需要 CRISPR 序列和 Cas 蛋白，还需要另外一种叫做 tracrRNA 的全新 RNA 分子给予配合。同年3月，一场学术会议让 Emmanuelle Charpentier 教授与 Jennifer A. Doudna 教授不期而遇。Jennifer A. Doudna教授在 RNA 研究上卓有建树，且对 CRISPR 机制研究亦有所涉略。 两位学者有着很多共同点：她们的团队都在研究细菌防御病毒入侵的机制；二人实验室的研究生 Krzysztof Chylinski 和 Martin Jinek 在毗邻的城镇长大，说着同样的波兰方言…… 命运就是这样充满巧合，二人间天衣无缝的合作或许冥冥之中早已注定。 Emmanuelle Charpentier 教授当即向 Jennifer A. Doudna 教授发出合作邀请，两人一拍即合，携手开启了 CRISPR 机制的发现之路。仅仅一年后，她们便阐明了 CRISPR 复杂系统中各个不同组成部分所扮演的角色，并在试管中重现了这一系统在细菌体内能做的事——对目标 DNA 进行剪切。更为重要的是，她们发现这一系统经过改造后可以在指定位点切开任何 DNA 分子，这为后续的基因编辑提供了无限可能。 与早期的 ZFN 和 TALEN 技术相比，新问世的 CRISPR/Cas9 技术更为简单高效，能在模型构建和疾病治疗等领域发挥重要的作用，属于 CRISPR 的时代正式到来：

• 2013年，哈佛大学医学院的 George Church、麻省理工学院博德研究所的张锋以及加州大学旧金山分校系统及合成生物学中心的亓磊，将 CRISPR/Cas 系统成功应用于哺乳动物细胞基因编辑。

• 2013年12月，Science 认定 CRISPR 基因编辑技术为当年的十大科学突破；

• 2015年12月，Nature 将 CRISPR 基因编辑技术评为“十大科学事件之一”；

• 2019年10月，刘如谦团队公布了一种先导编辑（Prime editing）技术，通过一系列 ABE 蛋白突变体，最大限度地减少了 CRISPR 基因编辑技术的脱靶效应，迈出了其临床应用的又一大步！

2020年10月，开发CRISPR基因编辑技术的两位科学家Emmanuelle Charpentier 和 Jennifer A. Doudna 荣获诺贝尔化学奖。  

图2：来源诺贝尔奖官网 

诺贝尔奖委员会在新闻稿中盛赞道，这是“划纪元”的发现！ 

奋勇正当时   

在问世后的10年里，CRISPR 技术的发展和应用势如破竹，在基因敲除、基因敲入、基因抑制和激活、多重编辑、功能基因组筛选等领域中大放异彩，为保卫人类的健康与福祉做出巨大的贡献，并创造出许多喜人的临床进展： 2014年6月，麻省理工学院的研究人员通过从尾部直接注射 CRISPR 的方式，治愈了患酪氨酸血症  （tyrosinemia，一种的罕见肝脏疾病）  的成年小鼠。 2019年11月，美国公布了首个 CRISPR 疗法临床试验阳性数据，CRISPR Therapeutics和 Vertex Pharmaceuticals 的 CRISPR/Cas9 基因编辑疗法 CTX001，在1/2期临床试验中取得了积极的中期疗效数据。一名输血依赖性β地中海贫血症  （TDT）  患者和一名严重镰状细胞贫血症  （SCD）  患者在接受 CTX001 治疗后，均达到了停止输血依赖的效果，这可谓是生命的奇迹！ 2020年，一位有失明风险的遗传病患者成为了全球首位直接接受 CRISPR–Cas9 体内基因治疗的人。波特兰俄勒冈健康与科学大学的医生向病人的视网膜中注射了一种被编码在病毒载体中的基因药物，以治疗 Leber 先天性黑内障病  （LCA10）  。 2021年12月3日，英国弗朗西斯·克里克研究所 Charlotte Douglas 等人以小鼠为模型，开发了一种合成的致死性双重 CRISPR/Cas9 策略，可以以 100% 的效率生产仅雄性或雌性的小鼠窝。即使用这种方法，研究人员能够100%有效地控制幼崽的性别。为了产下一窝雄性幼崽，研究人员编辑了父亲的X染色体，这意味着只有雌性继承了有害的突变，而对于一窝雌性幼崽，他们编辑了Y染色体。 2022年6月17日，美国格拉斯通研究所和斯坦福大学的研究人员通过 CRISPR 筛选揭开了 T 细胞耗竭的秘密。研究团队采用 CRISPR/Cas9 基因编辑技术来依次改变细胞中的数万个基因，以此分析T细胞在其T细胞受体持续激活后表现出的耗竭水平。这让研究人员能够确定哪些基因在触发T细胞耗竭中发挥重要作用。 除了医学领域的应用外，基础生物学家们也使用 CRISPR 技术来研究各个基因的功能；植物学家们则用 CRISPR 技术来改造作物，提高其对疾病的耐受能力；动物学家使用 CRISPR 技术更精确地培育具有高产量、高抗病性、更佳的营养比例和其他有益特性的牲畜品种。 CRISPR 技术是一把当之无愧的基因 “魔剪”，正在助力科学家们修改生命的蓝图！ 

未来的四个发展方向   

风云十年已过，CRISPR 技术仍充满希望。 日前，CRISPR技术先驱之一、诺贝尔化学奖获得者 Jennifer A. Doudna 教授在一场会议上分享了她对 CRISPR 技术的未来展望，对未来的四大发展方向进行了详细阐述。 

图3：来源Jennifer A. Doudna教授会议 

1、将为更多疾病提供彻底治愈的方法 

除了 Cas9，目前还有崭露头角的 Cas3  （能大段删除 DNA，堪称 DNA 碎纸机）  、Cas12、Cas13  （可用于疾病诊断）  、CasX  （体积更小，有望于在临床上完成基因递送）  等，将会为更多疾病提供治疗手段；Jennifer A. Doudna 教授表示CRISPR 技术在治疗疾病方面做出许多创新，不仅局限于罕见疾病，能为许多疾病带来正面影响。 令人振奋的是，科学家们正在通过生物工程技术，不断优化这些关键蛋白乃至整个CRISPR 系统的功能。碱基编辑技术能够对单个核苷酸进行精准的修改；通过“激活”或“沉默”基因，研究者们无需改变基因组，即可实现短暂调控基因的表达；而当 CRISPR 技术结合表观遗传学时，便是科研成果间的完美结合和碰撞。这种结合使得研究者们能够对指定的基因启动子片段进行甲基化或者去甲基化修饰，甚至有望对基因表达实现长久地关闭或开启。 

2、将催化出 “现货疗法”的时代 

Jennifer A. Doudna 教授指出，细胞和基因疗法带来了高度个体化的治疗方案，其治疗难度和花费令许多病人望而却步。然而，CRISPR 技术有望实现此类疗法的大众化——“如果不能应用于所有不同的人，那至少也在广泛的不同的人里有所应用。” 为实现这一目的，则必须对基因改造细胞的生产流程进行标准化。这个过程中，CRISPR 基因组编辑技术无疑将成为重要的工具。得益于基因编辑技术的不断进步，CAR-T 有希望被改造得更加全面和完善，并有望成为可以即时供应、惠及大众的通用细胞产品，即通用型 CAR-T  （UCART）  。UCART 有望改变自体 CAR-T细胞疗法带来的高昂成本和治疗复杂性，弥补其应用受限的缺陷。 

3、更快的诊断和药物发现 

充分地利用 CRISPR 技术的多样性，将其与人工智能相结合，更快地对致病基因进行高通量的自动化筛选，将促使研究人员更有效地找到新的治疗靶点。Jennifer A. Doudna 教授提到，目前 FDA 已经为一些基于 CRISPR 的诊断技术授予了紧急使用授权。而作为一种可编程的技术，只要经过简单的调整，即可用来检测来自各种病原体的各种 DNA 或是 RNA 分子。她认为，CRISPR 与人工智能的结合已经蓄势待发，将要为新药发现领域带来巨大的变革。 

4、将 CRISPR 技术视为一种预防工具 

比如已知的阿尔兹海默症或者心血管疾病，一些重要基因的存在会增加个体发病风险，另一些基因则会降低罹患疾病的风险。通过利用CRISPR提前改造致病高风险基因等方式，可以尽量避免疾病的发生，为人们制造出“基因保护伞”。 Jennifer A. Doudna 教授高屋建瓴式地提出的 CRISPR 技术的四大发展方向令人对这项技术的未来充满期待。 与此同时，研究 CRISPR 的另一位知名学者 Rodolphe Barrangou 教授也在庆贺 CRISPR 论文发表十周年的文章中提出了自己的期盼：研究基因组编辑的科学家们需要同时考虑技术背后的伦理，也需要为技术划定出使用的边界。迎接新技术的到来之时，也应该确保技术使用的公平和透明，在挑战与机遇并存的时代，抓住基因组编辑技术的未来【2】。 短短十年，科学界已是风云变幻。下一个十年，CRISPR 技术又将给人类带来怎样的惊喜与奇迹呢，让我们拭目以待！ 

参考文献  ： https://www.science.org/doi/10.1126/science.1225829 https://www.liebertpub.com/doi/10.1089/crispr.2022.29150.rba