三维预血管化微组织中成纤维细胞促进内皮细胞出芽及迁移的研究

唐珺，谈金女，叶朝阳，周燕，谭文松

华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室（上海  200237）

通信作者：周燕，Email：zhouyan@ecust.edu.cn

关键词：组织工程；微组织；预血管化；转瓶动态培养；三维共培养

引用本文： 唐珺, 谈金女, 叶朝阳, 等. 三维预血管化微组织中成纤维细胞促进内皮细胞出芽及迁移的研究. 中国修复重建外科杂志, 2022, 36(7): 881-888. doi: 10.7507/1002-1892.202203028

 摘　要

目的     

构建三维预血管化微组织，探索三维共培养体系中人成纤维细胞（human fibroblasts，HFs）对人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）出芽和迁移的促进作用。

方法     

取HUVECs和HFs 培养传代至3～5代进行实验。在二维共培养体系中，将HFs 行PKH26染色且固定细胞密度后，与HUVECs以不同比例（1∶4、1∶1、4∶1）以及不同接种方式（两种细胞间隔48 h顺序接种、直接混合接种）共培养，荧光显微镜下观察血管网络形成情况。构建三维共培养体系，通过慢病毒转染分别用绿色和红色荧光蛋白标记HUVECs和HFs，将标记细胞接种于多孔微载体上，采用转瓶动态培养，分别制备HF微组织、HUVEC微组织、HF-EC微组织和HF&EC微组织；低渗结晶紫染色法观测微组织中细胞生长情况。将各微组织包埋于纤维蛋白凝胶中，激光共聚焦显微镜下观察HF微组织和HUVEC微组织中细胞生长贴附情况，4种微组织出芽情况以及HF-EC微组织、HF&EC微组织芽体细胞组成、出芽数量及芽体长度。制备HFs条件培养基，观察其对HUVEC微组织出芽的影响，以正常培养基培养作为对照。

结果     

二维共培养时HFs预培养有助于血管网状结构形成与稳定，且当两种细胞比例为1∶1时效果最佳。三维共培养时各微组织上细胞生长良好，HUVEC微组织无出芽，HF微组织、HF-EC微组织、HF&EC微组织均能出芽，具备良好血管化能力。HF-EC微组织芽体长度及出芽数目均优于HF&EC微组织（P<0.05）。共培养微组织中HF微组织先于HUVEC微组织出芽，两者出芽轨迹一致，芽体由HFs 和HUVECs组成。在HFs 条件培养基中，HUVEC微组织也能出芽。

结论     

在转瓶中按1∶1比例顺序接种HFs 和HUVECs 可制备HF-HUVEC预血管化微组织，且在三维共培养中HFs能够引导和促进HUVECs出芽及迁移。

正　文

研究表明，构建预血管化骨组织对于提高其体内活性、促进骨缺损修复具有重要作用[1-2]。MSCs和内皮细胞（endothelial cells，ECs）共培养构建预血管化骨组织的研究发现，在成骨诱导培养基中两种细胞共培养虽能促进MSCs成骨分化，但因受诱导培养基成分、成骨分化MSCs的因子表达、MSCs与ECs 直接接触等影响，ECs血管形成受到抑制[3-6]。因此，需要探索预血管化骨组织构建的新策略。

微组织是指将细胞接种到几百微米的三维支架上，经培养后形成的微型构建物（也称模块组织）。我们设想分别构建骨微组织和预血管化微组织后，将两者直接注入体内或组装成预血管化骨组织注入体内来修复骨缺损。本团队前期成功构建了骨微组织[7]，本次研究旨在进一步构建预血管化微组织。既往研究发现，人成纤维细胞（human fibroblasts，HFs）在ECs血管化过程中具有重要作用，通过分泌细胞因子和细胞外基质促进ECs出芽并稳定新生芽体[8]。为此，本研究拟选择HFs和人脐静脉ECs（human umbilical vein ECs，HUVECs）共培养，构建预血管化微组织。

共培养体系是指将两种及以上的细胞共同培养于同一培养基或载体上所形成的体系。二维共培养体系在血管化调控机制研究中具有重要作用，但无法模拟体内复杂微环境及用于构建移植的预血管化微组织[9]。三维共培养体系是指将两种及以上的细胞共同培养于三维体系中，尽可能减小体外与体内环境的差异。目前，体外构建预血管化微组织相关研究中，采用的三维共培养体系包括直接将ECs 和HFs接种于基质胶中的共培养模型，或在两层基质胶中接种ECs 的“三明治”模型[10]，或将ECs 和周细胞共培养于胶原蛋白凝胶内的腔体通道中[11]，但将这些培养组织进行移植修复时，操作存在一定难度。有研究将ECs接种于微载体上并包埋于凝胶中，但多为单一细胞培养，鲜有共培养研究相关报道[12]。本次研究将HFs和HUVECs共培养于多孔微载体上，构建三维预血管化微组织，并将其包埋于纤维蛋白凝胶中，探索在三维培养环境中HUVECs 的出芽过程及HFs对HUVECs迁移的  促进作用，为规模化制备预血管化微组织奠定基础。

1

临 床 资 料

1.1    实验细胞及主要试剂、仪器

婴儿包皮来源HFs由本实验室分离并保存[13]。HUVECs 购自上海复蒙基因生物技术有限公司。

Cytopore 2微载体（GE 公司，美国）；DMEM培养基（GIBCO公司，美国）；FBS（HyClone公司，美国）；青霉素、链霉素（上海碧云天生物技术有限公司）；结晶紫、PKH26（Sigma公司，美国）；纤维蛋白原、凝血酶、抑肽酶（上海索莱宝生物科技有限公司）；绿色荧光蛋白慢病毒（pLenti-green fluorescent protein，pLenti-GFP）、红色荧光蛋白慢病毒（pLenti-red fluorescent protein，pLenti-RFP）由中国科学院上海生命科学院惠利健教授提供。

搅拌转瓶（Coring公司，美国）；荧光显微镜、激光共聚焦显微镜（Nikon公司，日本）；超净工作台、CO2 培养箱（Thermo Fisher Scientific公司，美国）；离心机（Beckman Coulter公司，美国）；  Image J图像处理软件（美国国立卫生研究院）。 

1.2    细胞培养

HUVECs和HFs均采用含10%FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM培养基，置于37℃、5%CO2 及饱和湿度培养箱中培养，待生长至90%左右融合度时行细胞传代。取第3～5 代细胞备用。

1.3    二维共培养体系构建及观测

1.3.1    PKH26染色　HFs 以胰蛋白酶消化，形成单细胞悬液；以离心半径15 cm，1 500 r/min 离心5 min；无血清培养基洗1 次，吸去上清，加入PKH26 染色液，吹匀细胞并置于培养箱孵育3～5 min；加入等量FBS终止染色反应1 min；加入等量含10%FBS的DMEM 培养基稀释中止反应液；以离心半径15 cm，1 500 r/min 离心10 min；  洗涤重悬细胞并计数，用于二维共培养。

1.3.2    二维共培养及观测　① 取PKH26染色的HFs，调整并固定细胞密度为5.0×104个/mL，在此基础上按照HFs∶HUVECs为1∶4、1∶1、4∶1比例取相应数量HUVECs。② 根据不同接种方法，实验分为HF-EC组及HF&EC组。HF-EC组：顺序接种2种细胞，即首先将HFs接种于24孔板（每孔1 mL），于37℃、5%CO2及饱和湿度培养箱中采用DMEM培养基培养48 h 后，再按照上述比例分别接种HUVECs。HF&EC组：取HFs 及HUVECs按照上述比例直接混合接种于24 孔板培养。每组重复3孔。③ 采用荧光显微镜自培养开始连续10 d观察各组细胞形态，PKH26染色的HFs 呈红色，分析不同细胞比例及HFs 预培养对血管网络形 成的影响。

1.4    三维共培养体系构建及观测

1.4.1    慢病毒转染细胞　

分别取3.0×105个HUVECs和HFs，接种于直径6 cm的平皿中，于37℃、5%CO2 及饱和湿度培养箱中采用DMEM培养基培养24 h 后，分别加入200 μL pLenti-GFP （HUVECs）或pLenti-RFP（HFs），以及培养基总体积1/1 000的Polybrene溶液。24 h 后更换新鲜培养基并继续培养，直至荧光显微镜下观察细胞表达绿色或红色荧光。

1.4.2    微组织制备及观测　

① 微组织制备方法：于搅拌转瓶中加入浓度为2.0 mg/mL的Cytopore 2微载体，灭菌处理后于DMEM 培养基中孵育过夜；取1.4.1中经慢病毒转染的细胞（2.0×105 个/mL）接种至瓶中，每瓶50 mL；加入DMEM 培养基，以转速60 r/min培养48 h 后获得微组织（图1a）。

实验共制备4 种微组织，其中HF微组织为微载体仅接种HFs， HUVEC微组织为仅接种HUVECs；HF&EC微组织为直接混合接种两种细胞；HF-EC微组织为先接种HFs并培养48 h 后，再接种HUVECs继续培养48 h。

② 观测指标：采用低渗结晶紫染色法对微组织中细胞进行计数。具体方法：自接种后每隔2 d取1 mL HUVEC微组织或HF微组织，连续14 d；将微组织置于EP管中，PBS漂洗后加入0.1% 结晶紫染色液，维持终体积为1 mL，37℃振荡5 h，用血球计数板计数细胞核，计算细胞密度，表示微组织  上细胞生长增殖情况。

1.4.3    三维共培养体系构建　

首先取24孔板，每孔加入0.5 U/mL凝血酶和0.15 U/mL抑肽酶各5 μL，混匀后加入用DMEM培养液配置的5.0 mg/mL纤维蛋白原溶液200 μL，待其凝固，制备成铺有纤维蛋白凝胶的孔板。然后，每孔再次添加纤维蛋白溶液200 μL，分别加入1.4.2 中制备的4种微组织，每组重复3孔；迅速加入凝血酶5 μL，置于37℃培养箱中凝固30 min，构建微组织包埋于纤维蛋白凝胶的三维共培养体系。最后，每孔添加DMEM培养基，置于37℃、5%CO2 及饱和湿度培养箱中培养（图1b）。

图 1     微组织制备及三维共培养体系构建流程图     a. 微组织制备；b. 三维共培养体系

1.4.4    三维共培养后观测　

培养1、3 d，激光共聚焦显微镜观察HF微组织和HUVEC微组织中细胞生长及贴附情况。培养3 d，激光共聚焦显微镜观察4种微组织出芽及HF-EC微组织、HF&EC微组织芽体细胞组成，采用Image J图像处理软件计算  HF-EC微组织、HF&EC微组织出芽数量及芽体长度。 

1.5    HFs分泌的细胞因子对HUVEC微组织出芽的影响

取1.4.1 中标记红色荧光的HFs接种于T150瓶中，于37℃、5%CO2 及饱和湿度培养箱中采用DMEM培养基培养，待生长至约90% 融合度后，更换为无血清DMEM培养基继续培养48 h；取培养液，添加10%FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素，配制成HFs条件培养基。

取1.4.2 中制备的HUVEC微组织置于24孔板，分别采用HFs条件培养基（实验组）或含10%FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM培养基（对照组）培养，每组重复3孔。培养1、3、5 d，激光共聚焦显微镜下观察HUVEC微  组织出芽情况。

1.6    统计学方法

采用Excel软件统计分析。计量资料行正态性检验，符合正态分布时，数据以均数±标准差表示，  组间比较采用独立样本t检验；检验水准α=0.05。

2

结　果

2.1    二维共培养观测

荧光显微镜下观察示，细胞比例为1∶4时， HF&EC组细胞聚团，未能形成血管样结构；而HF-EC组形成了明显且稳定的血管样结构。比例为1∶1 时，HF&EC组仅在 2 d 时短暂出现了血管样结构，之后迅速退化成细胞簇；而HF-EC组培养2 d时即形成血管样结构，直至10 d 时仍能见部分血管样结构。比例为4∶1 时，HF&EC组可形成比较稳定的血管样结构，培养至6 d时才能观察到网状结构形成；而HF-EC组培养至10 d时仍无网  状结构形成。见图2。

图 2     荧光显微镜观察细胞接种比例及HFs预培养对血管网络形成的影响（×40）     从上至下分别为培养2、6、10 d；从左至右分别为HF&EC组及HF-EC组　a. 1∶4；b. 1∶1；c. 4∶1

2.2    微组织中细胞生长观察

低渗结晶紫染色法检测示，HUVECs 和HFs均能在2 d内完全贴附于微载体。0～4 d为细胞生长延滞期，增殖缓慢；4 d后进入对数生长期，细胞快速增殖。培养至14 d时，HUVECs 和HFs密度分别为17.6×105 个/mL和11.7×105 个/mL，与接种时  相比分别扩增了9倍和6 倍。见图3。

图 3     微组织中细胞生长曲线     a. HUVEC微组织；b. HF 微组织

2.3    三维共培养对微组织出芽的影响

2.3.1    微组织中细胞生长贴附观察　激光共聚焦显微镜下见，HUVEC微组织和HF微组织包埋后1 d细胞即均匀贴附于微载体上；培养至3 d时， HUVEC微组织上的细胞仍紧密贴附于微载体上，而HF微组织中的细胞迁出微载体，呈现出芽现  象。见图4。

图 4     激光共聚焦显微镜观察微组织中细胞生长（×100）     从左至右分别为HUVEC微组织、HF微组织　a. 培养1 d；b.培养3 d

2.3.2    出芽情况观察　

培养3 d 时，除HUVEC微组织没有出芽外，其余3 种微组织均有出芽现象，这些芽从微组织中伸出，呈树枝状伸展且分叉。其中，HF微组织出芽较少，芽体较短。而HF-EC微组织和HF&EC微组织出芽较多，芽体较长，出芽轨迹几乎一致；芽体轴部（微组织近端）和中部均由HUVECs 和HFs共同形成，但芽体顶部（微组织远端）只有HFs，且HFs正在形成芽的分叉；HF-EC微组织芽体中部HUVECs比HF&EC微组织更多。见图5、6。

图 5     激光共聚焦显微镜观察三维共培养对微组织出芽的影响      从左至右分别为HF 微组织、HUVEC 微组织、HF-EC 微组织、HF&EC 微组织　a. 明场图（×40）；b. 荧光图（×100）

图 6     激光共聚焦显微镜观察HF-EC微组织及HF&EC微组织芽体细胞组成     从上至下分别为HF-EC微组织、HF&EC微组织　a. 芽体（×200）；b～d. 芽体轴部、中部及顶部（×500）

HF-EC微组织出芽数量及芽体长度分别为（24.2±2.6）个、（405.1±100.8）μm，均高于HF&EC组的（15.8±1.7）个、（349.8±106.5）μm，差异均有统  计学意义（t=5.852，P=0.001；t=2.120，P=0.039）。 

2.4    HFs分泌的细胞因子对HUVECs出芽的影响

激光共聚焦显微镜观察示，对照组HUVECs未出芽，5 d时HUVECs迁出微组织，在微组织周围形成细胞圈。实验组HUVEC微组织在3 d时即  有出芽，至5 d时出芽更明显。见图7。

图 7     HFs分泌的细胞因子对HUVEC微组织出芽的影响 （激光共聚焦显微镜×100）     从上至下分别为培养1、3、5 d；从左至右分别为明场图及荧光图　a. 对照组；b. 实验组

3

讨　论

传质限制是工程化骨组织体外构建和体内移植面临的瓶颈问题之一，通过微组织工程技术能有效解决体外构建物中的传质限制，而工程化骨组织的预血管化可进一步提高植入体内后移植物的活性，有助于骨组织缺损修复。然而，在成骨诱导环境中MSCs和ECs共培养虽可促进MSCs成骨分化，却不利于ECs血管网络形成，因此需要分别构建骨微组织和预血管化微组织，再进行组织修复。

为了构建预血管化微组织，研究者尝试了多种培养体系，如将ECs包埋于纤维蛋白凝胶或其他材料组成的凝胶中[14]，但凝胶中细胞密度有限，且无法实现规模化制备。也有研究将细胞单独培养于温敏聚合物上形成细胞层，再将形成的细胞层膜片通过逐层堆积的方法构建三维组织；但该方法因中心传质限制问题，构建的组织尺寸受限[15]。另有研究者采用由壳聚糖-聚赖氨酸-海藻酸盐多层膜包封负载细胞的聚己内酯微粒[16]，该微囊内部呈液态，可以解决内部传质限制的问题。但该构建方法复杂，且缺乏一定基质硬度，而基质硬度对体外血管化也具有一定作用。本研究采用细胞共培养于多孔微载体的方法，细胞密度高且具有基质刚性，具备规模化制备的潜力。通过引入转瓶动态培养技术，能够有效解决传质限制的问题，同时给予细胞一定的机械刺激。有研究表明在生物反应器的动态培养环境中，机械刺激能够有效促进ECs体外预血管化[17-19]。

体外构建预血管化组织模块时，除了需要ECs 之外，支持细胞的存在也同样重要。成纤维细胞作为来源广泛的支持细胞之一，通过分泌基质金属蛋白酶降解细胞外基质，促进ECs迁移；分泌的细胞因子和细胞外基质，如bFGF、VEGF以及Ⅰ、 Ⅵ型胶原等，有利于ECs增殖、迁移和新生血管的稳定。因此，本研究中采用HFs 与HUVECs 共培养，成功构建了具有血管化能力的微组织。另有研究报道了MSCs对ECs血管化的促进作用[20]，且MSCs具备更高的分化能力，为同种异体移植提供了有利条件。因此，未来可以开展采用MSCs进行预血管化模块构建的研究。

关于HFs 引导HUVECs迁移的调控机制，目前尚未明确。Costa-Almeida等[8]提到在大血管形成中，成纤维细胞通过沉积细胞外基质支持ECs迁移，也通过分泌细胞因子促进血管发生。在分泌的细胞因子中，VEGF颇受关注，其与ECs激活成为尖端细胞以及引导尖端细胞定向迁移有关[21-23]。细胞外基质成分比较复杂，其中纤连蛋白与毛细血管发生有关[24]，Ⅰ型胶原和Ⅵ型胶原蛋白与ECs出芽的数目和长度有关[25]，Ⅷ型胶原蛋白还被认为能够促进ECs 迁移[26]。本研究中HF-EC微组织出芽数目多于HF&EC微组织，可能是由于HFs预接种的HF-EC微组织中沉积了更多的细胞外基质，从而促进HUVECs出芽。因此，今后需进一步研究HFs分泌物的成分组成，探索关键组分对HUVECs出芽的影响及相关调控机制，以促进预血管化微组织的血管形成。

综上述，本研究采用多孔微载体通过HFs预培养并以1∶1 比例接种HUVECs，在转瓶中成功构建了具备预血管化能力的共培养微组织，并初步证明在该微组织中HFs能够促进和引导HUVECs出芽。今后需要进一步开展血管生成体外、体内分析检测工作，如结合图像分析技术，对形成的血管样结构进行半定量表征；定量检测HUVECs血管生成标志物的表达；基于鸡胚绒毛尿囊膜血管生成模型以及其他动物模型（包括组织缺损模型）进行动物实验，为二维和三维细胞共培养对血管生成影响及相关机制的探究、组织缺损修复的应用提供更多数据支持。

参考文献：略

本文封面图片来源于网络，侵删 

CJRRS

中国修复重建

外科杂志