科研丨广西医科大学(IF:10.46): 肠道微生物群介导与2型糖尿病相关的褪黑素信号传导（国人佳作）

编译：微科盟花猫中医，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读  

褪黑素在啮齿动物的2型糖尿病中发挥有益作用，但其在人类中的作用仍存在争议。本研究通过一项病例对照研究调查了中国南方人群血清褪黑素与2型糖尿病风险之间的关系以及肠道微生物群在这一关系中的作用。本研究从一项横断面研究中招募2型糖尿病患者(病例组)和健康个体(对照组)(n=2034)，并在病例对照研究中匹配年龄和性别。测量血清褪黑素水平，并使用多变量逻辑回归模型检查血清褪黑素与2型糖尿病风险之间的关联。进一步进行严格匹配的病例对照研究(n=120)，16S rRNA测序表征肠道微生物，并使用LC-MS/MS非靶向代谢组学分析微生物代谢物。结果表明，在校正协变量后发现血清褪黑激素水平升高与2型糖尿病风险降低(OR：0.82[95%CI：0.74,0.92])以及空腹血糖水平降低(β −0.25[95%CI：−0.38, −0.12])显著相关。2型糖尿病患者的肠道微生物群发生改变，其中血清褪黑素水平降低，肠道微生物群α多样性和β多样性降低(p<0.05)，双歧杆菌丰度增高，粪球菌丰度降低(线性判别分析，[LDA]>2.0)。7个菌属与褪黑素和2型糖尿病相关特征相关；其中双歧杆菌与血清脂多糖(LPS)和IL-10呈正相关，而粪球菌与血清IL1β、IL-6、IL-10、IL-17、TNF-α和LPS呈负相关。此外，在2型糖尿病患者中还检测到代谢物改变，并且色氨酸(Trp)代谢物与褪黑素相关菌属(包括双歧杆菌和粪球菌)之间存在显著相关性(FDR<0.05)。同样，Trp代谢物和炎症因子如IL-1β、IL-6、IL-10、IL-17、TNF-α和LPS之间也存在显著相关性(FDR<0.05)。此外，我们发现Trp代谢物可作为预测2型糖尿病状态的生物标志物(AUC=0.804)。综上，较高水平的血清褪黑素与较低的2型糖尿病风险相关。肠道微生物介导的褪黑素信号与此相关，特别是双歧杆菌和粪球菌介导的Trp代谢物可能参与了这一过程。这些发现揭示了褪黑素和褪黑素相关细菌及其代谢物作为2型糖尿病潜在治疗靶点的重要性。  

论文ID

原名：Gut microbiota mediate melatonin signalling in association with type 2 diabetes

译名：肠道微生物群介导与2型糖尿病相关的褪黑素信号传导

期刊：Diabetologia

IF：10.460

发表时间：2022.6

通讯作者：张海英，莫曾男，林睿

通讯作者单位：广西医科大学

DOI号：10.1007/s00125-022-05747-w

实验设计

结果

1 糖尿病与褪黑素关联研究中纳入个体的特征

本研究主要探讨血清褪黑素与2型糖尿病风险之间的关系，共计纳入2034名参与者，包括678名2型糖尿病患者(病例组)与1356名健康个体(对照组)，具体特征如表1所示。结果显示，对照组的血清褪黑素水平显著高于病例组(195.55 vs 180.73 pmol/l，p=0.011)，但是，仅在夏季(冬季没有)具有统计学差异。除此之外，病例组和对照组在性别和年龄上没有明显差异。

表1. 2型糖尿病患者(病例)和匹配对照个体的特征。

2 血清褪黑素与2型糖尿病风险的关系

在匹配年龄和性别后，logistics回归分析结果显示血清褪黑素水平升高与2型糖尿病风险降低显著相关(OR: 0.84[95%CI: 0.76,0.92])，进一步调整其他协变量后结果依旧显示显著相关(OR: 0.82[95%CI: 0.74,0.92])，如表2所示。当按性别对人群进行分组时，这种显著相关性在男性中持续存在(p=4.48×10−4)，在校正协变量后，在女性中几乎达到统计学显著性(p=0.056)。当血清褪黑素按三分位数分组时，在校正协变量后，最高与最低类别的OR为0.75(95%CI: 0.59,0.95；ptrend=0.018)(表2)。除此之外，本研究还发现较高水平的血清褪黑素与较低水平的空腹血糖(FGB)显著相关，因此在调整协变量后发现，当血清褪黑激素增加1 pmol/l时，FBG降低0.25 mmol/l(β −0.25[95%CI: −0.38, −0.12])，如表3所示。

表2. 血清褪黑素与2型糖尿病的关系。

表3. 血清褪黑素与2型糖尿病相关特征的关系。

3 肠道菌群在褪黑素与2型糖尿病关系中的作用

3.1 纳入个体的特征

在严格匹配年龄、性别、BMI、饮酒量和粪便特征等变量后，本研究选择2019年7月和2020年7月从南宁市招募的个体作为研究对象，其中包括40例2型糖尿病患者(病例组)和80名健康个体(对照组)。病例组和对照组之间的一般特征没有显著差异，但“受教育程度”除外。与对照组相比，2型糖尿病患者的血清褪黑素水平明显较低(26.74 vs 28.81 pmol/l，p=0.015)(表4)。

表4. 纳入的2型糖尿病参与者和匹配对照参与者的特征。

3.2 褪黑素水平较低的2型糖尿病患者肠道菌群组成的变化

在16S rRNA测序后，共捕获3 818 454条优化序列，覆盖率超过99.7%。在门水平上，2型糖尿病患者的变形菌门丰度显著增加(10.3% vs 6.4%，p=0.006)，如图1a所示。α多样性分析显示，与对照组相比，病例组的微生物群多样性显著降低(Shannon指数较低，Simpson指数较高，p<0.05；图1b、1c)。β多样性分析(加权UniFrac距离)显示，与对照组相比，病例组样本之间的距离明显更小(p=0.009)(图1d)，表明2型糖尿病患者的肠道微生物结构与对照个体不同。根据LDA(LDA>2.0)分析的细菌群落特征显示，两组共有15个差异属，其中11个属在对照组更丰富(包括粪球菌属Coprococcus)，4个属在病例组中更丰富(包括双歧杆菌属Bifidobacterium，图2a)。值得注意的是，在病例组中，纲水平(放线菌纲)、目水平(双歧杆菌目)和科水平(双歧杆菌科)上也显示出更高丰度的双歧杆菌(图2b)。

图1. (a)病例组和对照组在门水平上的相对丰度比较;(b)病例组和对照组之间α多样性(Shannon指数)比较；(c)病例组和对照组之间α多样性(Simpson指数)比较；(d) 病例组和对照组之间β多样性的比较(加权UniFrac距离，Anosim检验)。(*p<0.05，**p<0.01)。

图2. (a)病例组和对照组之间的分类群丰度不同。(b) LDA Cladogram图。红色和蓝色圆圈分别代表病例组和对照组中的重要分类群；绿色圆圈代表没有重要作用的分类群。LDA效应大小>2.0、FDR<0.05设置为显著性。

3.3 与褪黑素和2型糖尿病相关特征相关的关键类群

在属水平上，我们发现48个属中有7个属与褪黑素和2型糖尿病相关特征相关。其中，双歧杆菌丰度越高，褪黑素水平越低，但血清HbA1c和C肽水平越高(p<0.05)；而粪球菌丰度越高，褪黑素水平则越高，血清IL1β、IL-6、IL-10、IL-17、TNF-α和LPS水平越低(FDR<0.05)，如图3所示。

图3. 与褪黑素和2型糖尿病相关特征相关的关键类群。使用广义线性回归(GLM)模型进行检验，*FDR<0.05和**FDR<0.01。

4 肠道微生物代谢物分析

4.1 褪黑素水平较低的2型糖尿病患者代谢物改变

使用LC-MS/MS非靶向代谢组学方法在正模式和负模式下分别检测到915和3890个峰。OPLS-DA分析显示，负离子模式下病例组和对照组之间明显分离(图4b)。负模型的预测精度为R2Xcum=0.507，R2Ycum=0.864，Q2cum=0.227(R2p=0.576；Q2p=0.01)(图4d)，正模型的预测精度为R2Xcum=0.495，R2Ycum=0.176，Q2cum=0.062(R2p=0.859；Q2p=0.01)，如图4c所示。此外，根据以下标准，即如果Q2点的红色回归线与纵轴相交于零或低于零，或者左侧的所有蓝色Q2值均低于右侧，我们的OPLS-DA模型可以识别出差异富集的代谢物，如图4c、图4d所示。最终，在VIP>1.25和FDR<0.05的标准下，共鉴定出1116种在病例组和对照组之间差异富集的代谢物。

图4. 正模式(a)和负模式(b)的OPLS-DA评分图，以及从肠道微生物群LC-MS代谢物谱中正离子模式(ESI+)(c)和负离子模式(ESI-)(d)得出的相应排列检验图。

4.2 代谢通路分析

进一步确定2型糖尿病显著改变的代谢通路，共发现38条差异富集代谢通路(FDR<0.05)，其中9条影响值超过0.185。与褪黑素生物合成有关的Trp代谢通路的影响值为0.187(FDR=0.005)。在参与Trp代谢通路的代谢物中，有10种在病例组和对照组之间存在显著差异(FDR<0.05，VIP>1.25)，且与褪黑素水平相关(p<0.01)，如表5所示。

表5. 参与Trp代谢的代谢物在病例组和对照组之间的差异及其与褪黑素的关系。

4.3 Trp代谢通路中菌群与代谢物之间的关系

对于与褪黑素和2型糖尿病相关特征相关的7个属，我们重点关注了它们与Trp代谢途径中代谢物之间的关系。如图5b所示，共有4个属与Trp代谢物相关(FDR<0.05)。在对照组中更丰富的粪球菌属与所有9种Trp代谢物均相关，而在病例组中更丰富的双歧杆菌属则与5种Trp代谢物相关。当我们进一步研究这些Trp代谢物与炎症因子之间的关系时，发现所有9种Trp代谢物均与炎症因子(即IL-1β，IL6，IL-10，IL-17，TNF-α和LPS)显著相关(p<0.05)(图5c)。有趣的是，褪黑素相关代谢物和菌群(粪球菌属和双歧杆菌属)均与炎症因子相关(图3和5c)。我们随后测试了这9种属相关代谢物是否可用于预测2型糖尿病状态，发现只有5-羟基吲哚乙酰甘氨酸、2-氧代褪黑素和色氨醇是潜在的预测因子(p<0.05)。三种代谢物组合的AUC为0.804，如图5d所示。值得注意的是，粪球菌属与5-羟基吲哚乙酰甘氨酸、2-氧代褪黑素和色氨醇呈负相关，而双歧杆菌属则与5-羟基吲哚乙酰甘氨酸和色氨醇呈正相关，如图5b所示。

图5 (a) MetPA通路分析总结。随着x和y值增加，颜色从白色渐变为黄色、橙色和红色。(b)褪黑素相关菌属与Trp代谢途径中涉及的代谢物之间的Spearman相关性(*FDR<0.05和**FDR<0.01)。(c) Trp代谢物与炎症因子之间的Spearman相关性(*FDR<0.05，**FDR<0.01)。(d)使用与褪黑素相关菌属相关的Trp代谢物区分病例组和对照组的ROC曲线。

讨论

本研究发现血清褪黑素水平与罹患2型糖尿病风险呈负相关，其潜在机制可能涉及肠道微生物重编程，如微生物组成和丰度的变化，其中双歧杆菌属和粪球菌属介导的Trp代谢物可能发挥了重要作用。

本研究通过一项匹配病例对照研究(n=2034)探讨了中国人群中血清褪黑素与2型糖尿病风险之间的关系。在此之前，曾有一项病例对照研究证实褪黑素水平与美国女护士的2型糖尿病发病率呈负相关(n=740)，另有一项横断面研究则表明褪黑素水平与日本男性的2型糖尿病风险相关(n=1096)。本研究纳入了更大的样本量，为血清褪黑素与2型糖尿病风险之间的关系提供了独特而有力的见解。我们的研究结果支持褪黑素与2型糖尿病风险之间的负相关性，并且这种相关性与糖尿病药物治疗无关。近年来，越来越多的证据表明褪黑素在调节微生物代谢、昼夜节律和肠粘膜免疫功能中发挥了重要作用。褪黑素通过调节肠道微生物群，预防肥胖并改善脂质代谢异常，而肥胖和脂质代谢障碍已被证明是2型糖尿病的风险因素。然而，目前仍没有直接证据表明褪黑素对肠道微生物群和2型糖尿病具有调节作用。

性别、年龄、BMI、地区、饮酒和粪便特征等因素可能会混淆人类的肠道微生物研究结果。本研究通过严格匹配的病例对照研究设计，在病例组和对照组之间没有观察到任何基本特征的差异，我们发现在血清褪黑素水平较低的2型糖尿病病例中肠道微生物组成发生了改变。在门水平上，病例组表现出更丰富的变形菌；在属水平上，双歧杆菌属和粪球菌属在病例组与对照组中呈现不同的丰度，且二者均与血清褪黑素和2型糖尿病相关特征相关。双歧杆菌通常与人类2型糖尿病呈负相关，但一项随机双盲安慰剂对照研究显示其与2型糖尿病呈正相关。在我们严格匹配的病例对照研究中，双歧杆菌在病例组中表现出更高的丰度，并且与HbA1c和C肽水平呈正相关(p<0.05)，表明双歧杆菌与2型糖尿病呈正相关。粪球菌是一种产生具有抗炎作用的短链脂肪酸的细菌，通过提供营养物质、增强肠上皮屏障功能和肠道免疫功能而在宿主中表现出有益作用。在多种疾病中观察到粪球菌的丰度降低，例如，在患有炎症性肠病和肺动脉高压的个体中观察到粪球菌丰度降低，而用二甲双胍治疗增加了2型糖尿病小鼠模型中粪球菌的丰度。在本研究中，我们还发现粪球菌在对照组中更为丰富，且其丰度与血清IL-1β、IL-6、IL-10、IL-17、TNF-α和LPS水平呈负相关，表明其对2型糖尿病的免疫调节和有益作用。值得注意的是，我们发现双歧杆菌和粪球菌均与血清褪黑素和2型糖尿病相关特征相关，目前鲜有研究报道这种关系。最近的研究证实了褪黑素在肠道微生物群-免疫系统轴中的作用，褪黑素介导粘膜免疫细胞功能和微生物代谢，涉及脆弱拟杆菌(Bacteroidetes fragilis)、Prevotella intermedia和LPS。相关临床试验表明，口服褪黑素可以改善溃疡性结肠炎的肠道症状，并将双歧杆菌确定为溃疡性结肠炎的病原菌。在本研究中，我们发现参与Trp代谢途径的代谢物与粪球菌和双歧杆菌相关，并且二者均与血清褪黑素水平显著相关。众所周知，Trp代谢途径与褪黑素生物合成直接相关。据报道，色氨酸对肠道微生物组成和代谢具有深远影响，并通过“微生物群-肠道-免疫轴”影响宿主免疫系统。事实上，我们还观察到Trp代谢物与炎症因子(包括IL-1β、IL-6、IL-10、IL-17、TNF-α和LPS)之间存在显著相关性。在人类研究中，6种循环色氨酸代谢物(色氨酸、吲哚乳酸等)已被确定与2型糖尿病的发病率相关。虽然我们在肠道微生物群中没有检测到相同的色氨酸代谢物，但当我们使用参与色氨酸代谢途径的菌属相关代谢物预测2型糖尿病时，我们发现色氨酸代谢物(5-羟基吲哚乙酸、2氧褪黑素和色氨醇的组合)对于预测2型糖尿病具有重要意义。综上所述，本研究表明，褪黑素可能通过肠道微生物Trp代谢调节2型糖尿病患者的肠道微生物群-免疫轴。

本研究具有以下优点：首先，据我们所知，本研究是首次描述中国人群中褪黑素与2型糖尿病关系的研究。本研究采用血清褪黑素作为标记物，与之前的研究相比，本研究纳入样本量更大，通过使用严格匹配的病例对照研究设计发现褪黑素与2型糖尿病风险之间的负相关性，这与美国和日本人群的研究结果一致。此外，由于人类生活方式和生理特征可能对微生物群产生不同影响，我们设计了一项严格匹配的病例对照研究，以探讨肠道微生物群在褪黑素和2型糖尿病之间关系中的作用，本研究在比较所有基本特征后并未发现病例组和对照组之间的差异。这些设计特点使我们能够独立探索肠道微生物群在褪黑素与2型糖尿病关系中的作用。我们发现2型糖尿病患者的肠道微生物群(尤其是双歧杆菌和粪球菌)发生改变，血清褪黑素水平降低，表明褪黑素相关菌属和其介导的Trp代谢物可能在这种关系中发挥重要作用。本研究的局限性在于，受限于病例对照研究的特性，本研究没有揭示血清褪黑素与2型糖尿病之间的因果关系。一项队列研究，尤其是孟德尔随机化研究，有望揭示褪黑素与2型糖尿病之间的因果关系(ESM 图3)，因为褪黑素受体基因MTNR1B的功能丧失和功能获得在不同人群中均有报道。虽然目前没有孟德尔随机化研究数据显示肠道微生物群与2型糖尿病之间的因果关系，但肠道微生物群的代谢物(如短链脂肪酸)已被证明是一个发病因素，这表明Trp代谢物与2型糖尿病之间的因果关系可能是未来探索的重点。此外，肠道微生物群的16S rRNA测序无法识别种水平上的细菌，因此未来需要进行宏基因组测序以揭示特定的细菌物种及其功能。

未来研究褪黑素与2型糖尿病之间的因果关系将验证当前分析的结果，同时还可以通过宏基因组测序和靶向Trp代谢物分析探索相关肠道微生物群的潜在机制，并可能将2型糖尿病的治疗靶点扩展到特定微生物物种。

结论

本研究将我们对褪黑素与2型糖尿病之间关系的理解扩展到中国人群中，同时发现了与肠道微生物群相关的潜在机制。总体而言，本研究结果表明，血清褪黑素水平越高，患2型糖尿病的风险越低，其潜在机制可能涉及肠道微生物群的改变，其中双歧杆菌和粪球菌介导的色氨酸代谢物可能是潜在机制之一。此外，本研究还表明褪黑素和褪黑素相关肠道微生物群及其代谢产物可能是2型糖尿病的有效治疗靶点。未来仍需要进一步的研究来验证褪黑素与2型糖尿病的因果关系。

原文链接： https://doi.org/10.1093/cdn/nzac069.024