肿瘤+非肿瘤，纯生信零实验也能发8分！

导语

冠状动脉疾病（CAD）中与CD8+ T细胞相关的生物标志物在肿瘤免疫微环境中的作用仍然未知。

背景介绍 肿瘤生信分析大家已经司空见惯了，今天小编为大家带来一篇肿瘤与非肿瘤疾病联合分析的文章。本文只使用公共数据，没有补充实验就发表了8分+的FII，题目为   Identification of Biomarkers Associated With CD8+ T Cells in Coronary Artery Disease and Their Pan-Cancer Analysis。

数据介绍

冠心病数据：来自GEO的GSE12288数据集，包含110个冠心病样本和112个对照样本。

CD8+ T细胞浸润水平和基因表达相关性数据：GSE12288，GSE34198和GSE66360。

肿瘤及对照mRNA表达数据：TCGA，CCLE和GETx。

分析流程

结果解析 

01   冠心病的基因表达数据分析  

作者从GEO数据库中获得了冠状动脉疾病的mRNA表达数据（GSE1228数据集），选择了664个变异系数大于0.1的基因进行后续分析。作者进行了基因集变异分析（GSVA）来探究与CAD相关的基因的潜在作用（图1，2）。这些基因在一些免疫相关途径中显著富集。

图1

图2

02   构建加权基因共表达网络（WGCNA）   首先 使用R包“CIBERSORT”确定数据集每个样本中不同免疫细胞亚型的比例 ，然后选择每个样本7种T细胞亚型的比例进行接下来的WGCNA分析。

基于GSE12288数据集中664个基因的表达水平，使用R包“WGCNA”构建了一个基因共表达网络。然后，作者计算了平均连锁和Pearson相关系数，并对该数据集中的所有样本进行了聚类分析。

图3

结果构建了一个以β=3为阈值的扩展优先网络（图3）。作者还使用动态混合切割方法来构建分层聚类树。每个叶子代表一个基因，每个枝代表一个模块，该模块聚合具有相似表达水平的所有基因。然后，将功能等效的模块汇总到一个大模块中，得到四个模块（图3）。

4个模块中的蓝色模块与CD8+T细胞的关系最为显著（P=4E-05；图3）。因此，将蓝色模块定义为hub模块。在该模块中，具有较高连锁的基因被鉴定为与CD8 + T细胞最相关的潜在必需基因。共选择9个基因（PAX8，ATP6V0C，MMP14，PSMF1，RAD23A，PRDX6，MKRN1，YBX3，FBXO7）作为候选hub基因（图3）。

图4

接下来，作者对模块的hub基因进行了GO和KEGG富集。在BP中，富集在调节蛋白质分解代谢过程，细胞氨基酸代谢过程和细胞内运输的正调节方面（图4）。在CC中，基因在蛋白酶体复合物，内肽酶复合物和黑色素体中显著富集（图4）。在MF中，基因在泛素-蛋白连接酶结合，泛素样蛋白连接酶结合和蛋白酶体结合中显著富集（图4）。在KEGG中，基因在亨廷顿病，蛋白酶体和帕金森病中富集（图4）。

03   hub基因的鉴定和验证  

利用GSE12288、GSE34198和GSE66360三个数据集鉴定并验证了PAX8、ATP6V0C、MMP14、PSMF1、RAD23A、PRDX6、MKRN1、YBX3与CD8+T细胞浸润水平的相关性，最终确定FBXO7、RAD23A和MKRN1为可靠的hub基因。FBXO7、RAD23A和MKRN1这三个中心基因都与这三个数据集中CD8+T细胞的浸润程度呈显著正相关（图5）。

图5

为了进一步探讨FBXO7、RAD23A和MKRN1基因在不同癌症中CD8+T细胞的表达值，接下来采用“ggplot”包获取并下载并可视化FBXO7、RAD23A和MKRN1表达值与TIMER数据库中CD8+T细胞的相关性。结果发现FBXO7的表达值也与多种癌症中CD8+ T细胞浸润的程度呈正相关（图6）（其次是RAD23A和MKRN1）。综上，hub基因与CD8+ T细胞浸润水平密切相关，并且在肿瘤免疫微环境中起着至关重要的作用。

图6

04   hub基因的甲基化水平   从DiseaseMeth 2.0数据库获得与冠状动脉疾病中3个hub基因甲基化水平相关的数据。分析显示，FBXO7显示出较低的甲基化水平 ，RAD23A具有更高的甲基化水平 ，而MKRN1的甲基化结果没有统计学意义（图7 ）。

图7

05   hub基因的相关性   相关性分析显示，FSXO7、RAD23A和MKRN1在GSE12288、GSE34198和GSE66360三个数据集中呈显著正相关（ 图8 ）。于是，作者分析了FBXO7，RAD23A和MKRN1在不同癌症中的相关性。除USC，MESO和CHOL外，FBXO7与其余癌 症中的MKRN1显著正相关（图9）。MKRN1与RAD23A在除MESO，LGG，UCS，CHOL，READ和BRCA以外的其余癌症中呈正相关（图9）。除UVM，CHOL，UCS，SKCM外，MKRN1在其余癌症中与RAD23A正相关（图9）。 作者进一步调查了不同细胞系中三个hub基因的相关性。 FBXO7与心脏组织中的MKRN1呈显著正相关（图9），FBXO7与心脏组织中的RAD23A呈显著正相关（图9），MKRN1与心脏组织中的RAD23A呈显著正相关（图9）。

图8

图9

06   小分子药物靶点分析  

将FBXO7，RAD23A和MKRN1输入CMAP (Connectivity Map)药物数据库，确定了11种可用于治疗冠状动脉疾病的药物，包括多柔比星、加巴喷丁、苏西布宗、普拉斯特龙等（表1）。

表1

07   GSEA基因富集分析  

作者这里分别使用“h.all.v7.4.entrez.gmt”和“c2.cp.kegg.v7.4.entrez.gmt”作为参考基因组，并进行富集（图10）。

图10

当使用“h.all.v7.4.entrez.gmt”作为参考基因组时，FBXO7与同种异体排斥反应，干扰素-γ响应和TNFα信号传导富集相关。除了炎症反应和干扰素-α反应外，RAD23A富集的五个基因集中的其他三个与FBXO7的相同。MKRN1在六个基因集富集，除了其中五个与RAD23A富集结果相同，另一组PI3k-Akt-MTOR信号是MKRN1特有的。

当使用“c2.cp.kegg.v7.4.entrez.gmt”作为参考基因组时，FBXO7富集了三组基因集，包括扩张型心肌病、肥厚型心肌病HCM、NOD样受体信号通路。RAD23A富集了6个基因集，其中三个以与FBXO7相同，另外三个在B细胞受体信号通路、移植物抗宿主病和致心律失常性右心室心肌病富集。MKRN1在四个基因集富集，三个与FBXO7富集结果一致（图11）。

图11

小编总结 

本研究思路新颖，将冠心病的生物标志物与肿瘤免疫微环境结合起来。使用GSE12288数据集进行WCCNA分析来鉴定 与CD8+ T细胞最相关的模块，然后进一步进行以下分析：利用GSE34198和GSE66360数据集验证hub基因FBXO7、RAD23A和MKRN1；这些hub基因表达水平与CD8 +T细 胞浸润在CAD和多种癌症中呈正相关；使用 hub基因预测CAD的潜在有效治疗药物；进行GSVA分析来进一步了解CAD和癌症之间的潜在生物学途径，例如IL6 JAK STAT3信号传导，干扰素-γ响应（IFN-γ）和IL2 STAT5信号传导等；对三个hub基因进行单基因GSEA分析。总之，作者将FBXO7，RAD23A和MKRN1鉴定为冠心病与CD8 + T细胞介导的免疫反应相关的生物标志物，同时它们又在各种癌症中起到潜在治疗靶点的作用。