快报｜肺结核患者外周血CD8+CD28-Treg细胞分布及临床意义

Distribution and clinical significance of circulating CD8+CD28- regulatory T cells in the peripheral blood of patients with pulmonary tuberculosis

Yu X, Lin Y, Chen H, Wu MJ, Huang LN, Song YY, Gu BB, Ye ZJ, Xu P, Zhang JP, Xu JC.

BMC Pulm Med. 2022 Jul 30;22(1):291. 

1.背  景

机体感染结核分枝杆菌（Mycobacterrium tuberculosis，MTB）后，产生的细胞介导免疫（cellular immunity，CMI）和迟发型超敏反应（delayed type hypersensitivity，DTH）在结核病的发生、发展、转归中起到重要作用。近年来，调节性T细胞异常增高与免疫应答及有关疾病的发生、发展日益受到重视。有研究显示，肺结核患者CD4+CD25high Treg细胞增加，考虑可能与肺结核患者细胞免疫低下有关，并导致肺结核迁延不愈、反复发作。而当Treg细胞被抑制，抗MTB免疫则可一定程度上得以恢复正常，所以Treg细胞可能是结核病免疫逃逸的一个重要因素。调节性T细胞主要通过细胞因子及细胞接触发挥免疫抑制作用。调节性T细胞通过抑制免疫系统对自身或外来抗原的免疫应答，参与疾病的发生发展。目前，已发现了多个调节性T细胞亚群，包括CD4+CD25high Treg细胞、CD8+CD28-Treg细胞等。

CD8+CD28-调节性T细胞是缺乏CD28分子的一类CD8+T细胞，对T细胞的活化起负性调控作用，在控制自身免疫性疾病、器官移植后排异反应等方面发挥着重要的调节作用。近年来研究证实，CD8+CD28-调节性T细胞是调节性T细胞的重要亚群，与CD4+CD25high Treg细胞一样具有免疫抑制功能。CD8+CD28-Treg可诱导APC细胞表面IL-3、IL-4等抑制性抗体表达上调，使其处于免疫耐受状态；下调CD80、CD86等共刺激分子的表达，抑制Th细胞活性。由于CD8+CD28-Treg可以分泌较多的IL-6，而IL-6可抑制IFN-γ功能并降低未感染MTB的巨噬细胞对IFN-γ刺激的敏感性，因此CD8+CD28-Treg细胞很可能参与了结核杆菌的免疫逃逸。但是现阶段还未有结核病与CD8+CD28-Treg细胞相关性的报道，因此本研究将系统分析外周血CD8+CD28-Treg细胞与结核病病程及免疫功能间的关系，为进一步明确结核病发生的免疫机制提供数据。

2.研究方法   

2.1 研究对象及入选标准
1.研究对象：收集2018年9月至2019年8月来自苏州市第五人民医院结核病科住院确诊的菌阳肺结核患者98例，病例的诊断符合肺结核诊断标准（WS 288-2017）。按肺部CT影像学严重程度结合患者临床特点进行分组，分为肺结核轻度组（Stage I）、重度组（Stage II）；另外根据痰涂片抗酸染色检查结果，将肺结核患者分枝杆菌的排菌量分为4个等级组：+、++、+++和++++。健康人标本均收集自苏州市第五人民医院体检中心，排除呼吸道感染等疾病，且血TB-IGRA结果为阴性。研究方案上报苏州市第五人民医院伦理委员会并获患者知情同意。
2.入选及排除标准：确诊肺结核病例符合肺结核诊断标准（WS 288-2017），同时全部筛选为痰涂片抗酸染色阳性（+及以上）和结核分枝杆菌培养阳性。将肺部CT影像学严重程度结合患者临床特点进行分组：将病变累及3个以上肺野，同时伴有咳嗽或咳痰或胸闷等呼吸道症状，或体温≥39°C，归纳为肺结核重度组（Stage II）；其余归纳为轻度组（Stage I）。研究的病例均排除其它合并感染性疾病，包括HIV、HCV、HDV和HBV感染，及排除糖尿病等其它并发症。
2.2 人外周血中调节性T细胞亚群的检测 有研究发现CD25是CD4+Treg细胞的标志物，通过实验我们也发现其表达水平与FOXP3和CD127表达水平相关（sFig. 1）。因此CD3+CD4+CD25high细胞在本研究中被认为是CD4+Tregs。采集健康人群和肺结核患者的外周血（100μL），加入抗体（CD3-APC、CD4-PerCP、CD25-FITC和CD28-PE）孵育15 min。然后，红细胞裂解液裂解红细胞，离心，PBS洗涤，重悬于0.5 mL PBS中，流式细胞仪检测，FlowJo软件分析。
2.3 痰涂片抗酸染色检查 采用抗酸染色法对痰标本进行检测并按照下列标准报告镜检结果：连续观察300个不同高倍镜视野未发现抗酸杆菌，结果记录为抗酸杆菌阴性(-)；连续观察300个不同高倍镜视野发现1~8条抗酸杆菌，结果记录为1~8条/300视野；连续观察100个不同高倍镜视野发现3~9条抗酸杆菌，结果记录为抗酸杆菌阳性(+)；连续观察10个不同高倍镜视野发现1~9条抗酸杆菌，结果记录为抗酸杆菌阳性(++)；每个高倍镜视野发现1~9条抗酸杆菌，结果记录为抗酸杆菌阳性(+++)；每个高倍镜视野发现抗酸杆菌≥10条，结果记录为抗酸杆菌阳性 (++++)。
2.4 结核分枝杆菌的培养 将收集的患者痰标本加入等量4%氢氧化钠，混匀。取5mL处理后标本置入已标记的尖底离心管中，强力振荡，混匀，加入PBS缓冲液，然后4000rpm离心15 min，去上清，加入1~2mL PBS，混悬。在BBL MGIL培养管中先加入含有营养添加剂（Growth Supplement）和杂菌抑制剂（PANTA）的混合添加剂0.8mL；用注射器抽取0.5mL已处理的样本注入MGIT培养管中；将接种好的MGIT培养管放入结核杆菌培养仪（BACTEC MGIT-960）中培养，由仪器自动扫描给出培养的结果是阴性或阳性。
2.5 肺结核患者肺部影像学检查与分析 肺结核病例经螺旋CT进行断层扫描检查，影像诊断结果由2位专科医师进行阅片，观察范围从肺尖至肺底，记录肺结核的CT 影像学特征，按照CT影像学严重程度同时结合患者临床特点进行分组：将病变累及3个以上肺野，同时伴有咳嗽或咳痰或胸闷等呼吸道症状，或体温≥39°C，归纳为肺结核重度组（Stage II）；其余归纳为轻度组（Stage I）。
2.6 统计学方法 建立数据库收集数据，均使用统计学软件GraphPad Prism 6.0 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, 美国)进行分析。各组间数据以Mean ± SEM来表示，计量资料采用 one-way ANOVA检验，相关性分析采用pearson检验，以p<0.05为差异具有统计学意义。

3. 结 果

3.1研究标本的临床基本数据

将入选研究样本分为2组进行研究分析：健康对照组（HC，n=43）和肺结核组（PTB，n=98）。对HC组和PTB组的年龄、性别、肺结核疾病严重程度、痰涂片和T细胞亚群进行分析（表1）。

3.2 HC和PTB外周血CD8+CD28-Treg细胞的检测与分析
采用流式细胞术分析HC组和PTB组的外周血CD8+CD28-Treg细胞的表达情况（图 1A）并利用Flowjo软件进行分析。结果表明，相对于HC组，PTB组外周血中CD8+CD28-Treg细胞亚群比均显著上升（图1）。

图1 HC组和PTB组外周血CD8+CD28-和CD4+CD25highTreg细胞的流式图和表达比例。(A) HC 组和 PTB 组外周血 CD8+CD28-和 CD4+CD25highTreg 细胞的流式图。(B-C) 统计学分析HC和PTB组中 CD8+CD28- 和 CD4+CD25highTreg 细胞的表达差异。
3.3 结核患者外周血CD8+CD28-Treg细胞与结核病病程间相关性的分析    
将I期和II期PTB患者CD8+CD28-和CD4+CD25highTreg细胞比例与HCs进行比较，II期患者CD8+CD28-Treg细胞比例显着高于HC组。I期和II期结核患者CD4+CD25highTreg细胞的百分比高于HC组（图2A-B）。 此外，根据肺结核患者痰涂片结果将患者分为+、++、+++、++++4组。比较这四组患者的CD8+CD28-和CD4+CD25highTreg细胞百分比。+++组和++++组CD8+CD28-Treg细胞百分比高于+组。++++组中CD8+CD28-Treg细胞的百分比高于++组（图2C）。但CD4+CD25highTreg 细胞的比例在各组间没有这种差异（图 2D）。

图2 外周血CD8+CD28-和CD4+CD25highTreg细胞比例与结核病患者病程的相关性。 (A) 统计分析 HC、PTB-Stage I 和PTB-Stage II 组中CD8+CD28-Treg 细胞表达的差异。 (B) 统计分析 HC、PTB-Stage I 和PTB-Stage II 组中CD4+CD25highTreg细胞表达的差异。 (C) 比较不同痰菌载量的肺结核患者亚组中CD8+人群中CD8+CD28-Treg细胞表达的差异。 (D) 比较不同痰菌载量的 PTB 患者亚组中 CD4+ 人群中 CD4+CD25highTreg 细胞表达的差异。 +：3~9 条/100 视野，++：1~9 条/10 视野，+++：1~9 条/视野和++++：≥10 条/视野
3.4 结核患者外周血CD8  +  CD28  -  Treg细胞与淋巴细胞亚群的相关性分析      
结核患者外周血CD8+CD28-Treg细胞百分比与淋巴细胞亚群水平相关。结果显示，PTB组CD8+CD28-Treg细胞比例与CD4+T细胞比例呈负相关，而与PTB组和HC组CD8+T细胞比例呈正相关（图 3A-D 和sFig. 2A-D)。PTB组和HCs中CD4+CD25high Treg细胞的比例与淋巴细胞亚群的水平之间没有关系（图3E-H和sFig. 2E-H）。

图3 PTB组外周血CD8+CD28-和CD4+CD25highTreg细胞频率与淋巴细胞亚群的相关性。(A-D) PTB 组外周血 CD8+CD28-Treg 细胞比例与淋巴细胞亚群的相关性。 (E-H) PTB 组外周血CD4+CD25highTreg 细胞比例与淋巴细胞亚群的相关性。  

讨论

CD8+CD28-Treg细胞是免疫抑制性细胞的重要亚群，研究表明其在肿瘤患者体内增高，参与了对抗肿瘤特异性免疫应答的抑制作用，并与肿瘤的进展密切相关，但在肺结核患者体内的分布及其与临床病症、淋巴细胞亚群比例等之间的相关性尚不十分清楚。本研究检测了肺结核患者体内CD8+CD28-Treg细胞群体的比例，将其与健康人群进行了比较，分析了其与淋巴细胞亚群、单核细胞比例之间的相关性。结果发现PTB患者外周血中的CD8+CD28-Treg细胞的比例高于健康人；此外，体内CD8+CD28-Treg细胞的比例在HC和PTB患者组均与CD4+T、CD8+T、CD19+B呈一定的正或负相关性；此现象与CD4+CD25high Treg有所不同，CD4+CD25high Treg只在PTB患者中与CD4+T、CD8+T呈相关性，而在HC中无此相关性。这表明，CD4+CD25high Treg很大程度上属于诱导性产生的细胞群体，随着疾病的产生、进展及免疫应答的启动与持续，其诱导产生的比例将会增高，从而对免疫应答的扩大产生抑制作用；而体内CD8+CD28-Treg细胞作为免疫细胞中的内在性群体，本来对免疫细胞各亚群的比例可能有潜在的制衡关系，随着肺结核等疾病的发生、进展及免疫应答的启动，其比例会增高，以限制过度的免疫应答；但在结核等慢性感染中，其比例的异常增加可能抑制了有效的应答。进一步的分析发现，体内CD8+CD28-Treg细胞比例随PTB患者病情严重程度而上升，以及随PTB患者MTB排菌量增高而上升，表明MTB抗原的刺激强度和病情恶化程度对CD8+CD28-数量能够产生影响。

本研究首先系统分析了CD8+CD28-Treg细胞群体与结核病间的关系，发现PTB患者外周血中免疫抑制性细胞亚群CD8+CD28-亚群比例显著增高且与结核患者免疫功能存在相关性。进一步研究还发现相比于CD4+CD25high Treg细胞，CD8+CD28-抑制性细胞亚群数量增高与PTB进展相关，其可能通过抑制免疫应答、在一定程度上影响免疫细胞亚群间的比例，导致PTB的进展。本研究结果提示CD8+CD28-Treg细胞群体可能是结核患者体内发挥免疫调节的重要免疫抑制性细胞亚群，其可能成为结核病免疫干预治疗的重要靶点。

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编辑：于   菲

审校：范永德

发布日期：2022-08-23