精准前沿丨基于ctDNA的MRD检测在根治性治疗非小细胞肺癌中的研究进展

该研究还对37例可评估患者在多个时间点进行了ctDNA治疗后监测，观察到使用这种一直呈阳性和从未呈阳性的ctDNA监测框架预测复发的敏感性和特异性均为100%（表2）。在72%的患者中，监测治疗后ctDNA先于影像学发现复发，中位时间为5.2个月。作者还利用CAPP-Seq数据开发预测基于血液的肿瘤突变负荷，并进一步确定了ctDNA数据中可操作的突变。在一项探索性分析中，使用这些数据来识别在MRD时间点可能受益于额外治疗的多个疾病进展患者。这些发现表明ctDNA可以提示ctDNA MRD和ctDNA监测可更早识别复发。ctDNA MRD的肿瘤基因组特征有助于预防复发。反之，ctDNA MRD检测不到的患者在经过明确的治疗后很可能被治愈，可能不需要巩固治疗。

 在Chaudhuri等人的研究发表5个月后，基于PACIFIC试验的结果，durvalumab（德瓦鲁单抗）被批准作为不可切除NSCLC患者CRT后的巩固免疫疗法。虽然durvalumab显著改善了CRT后的无病生存期（DFS）和总生存期（OS），但在接受CRT 5年后，三分之一的安慰剂组患者仍然存活。考虑到与一年免疫检查点抑制剂（ICI）治疗相关的成本和潜在的严重副作用，开发生物标记物以促进更大程度的个性化治疗是很重要的。

在此背景下，Moding等进行了一项回顾性研究，评估ctDNA MRD是否可以作为生物标志物去识别哪些接受CRT治疗的患者受益于ICI巩固治疗。在这项研究中，分析了65例不能切除的IIB-IIIB期非小细胞肺癌患者，他们接受了CRT巩固ICI治疗或CRT单独治疗。其中，28例患者在CRT后接受了巩固性ICI治疗，分别在CRT前、CRT后和ICI巩固早期采集血浆样本，使用CAPP-Seq，结果显示，在未巩固组和巩固组队列中，分别有78%和75%的患者具有可检测到的治疗前ctDNA。

在CRT治疗的无巩固组患者中检测到治疗前ctDNA，17例CRT治疗后可检测到ctDNA MRD，所有患者在随访12个月内复发，而在CRT治疗后ctDNA MRD检测不到的患者中，只有1例复发。在免疫治疗巩固组，22例治疗前ctDNA可检测的患者在完成CRT后有可评估的样本用于ctDNA MRD分析，其中13例经过CRT治疗后检测不到ctDNA MRD，其中两人在12月内出现复发。在其余9名CRT治疗后可检测到ctDNA MRD的患者中，那些ctDNA水平从ICI前到ICI早期下降的患者与同期ctDNA水平升高的患者相比获得更长的FFP。此外，有2例患者在约2个月的巩固ICI后，ctDNA MRD从可检测到不可检测，他们都获得了长时间的无病生存期。

NSCLC治疗后ctDNA MRD检测的一个主要挑战是血浆中ctDNA的低水平，通常低于0.1%。此外意义不明的克隆造血（CHIP）在血浆中呈低水平存在，并可能影响ctDNA检测的特异性。因此，ctDNA MRD分析需要具有极好的敏感性和特异性来检测通常在血浆中以极低水平出现的肿瘤基因组改变，同时也不会错误地称其为CHIP突变。背景错误率会进一步影响基于NGS的ctDNA检测的性能。

为了减少涉及深度测序的大多数ctDNA分析的固有误差，一种专注于跟踪单个cfDNA分子上的多个突变的新方法称为Phased Variant Enrichment以及近期不断的发展的PhasED-Seq。对来自5名局部NSCLC患者的14份血浆样本进行了分期测序，并与基于标准单核苷酸变异（SNV）的ctDNA方法进行了比较。采用标准的基于SNV的方法，ctDNA在14个血浆cfDNA样本中的5个中可检测到，而PhasED-Seq在10个样本中检测到ctDNA，其水平低至0.000094。在一个局部晚期肺腺癌患者比较了两种ctDNA MRD检测方法。SNV-based ctDNA分析方法和PhasED-Seq检测分析方法在治疗前ctDNA检测结果相似，但标准的基于SNV的方法在检测CRT期间，在CRT和ICI巩固之间，以及在ICI巩固处理中未检测到ctDNA MRD，而PhasED-Seq方法可以检测。这些结果表明，与传统的基于SNV的ctDNA分析相比，PhasED-Seq在检测NSCLC患者MRD时的DNA可能具有更高的敏感性。

2. ctDNA MRD在可手术非小细胞肺癌中的研究进展

作为前瞻性NSCLC肿瘤研究CTRACERx（NCT01888601）的一部分，Abbosh等人应用多重聚合酶链反应（PCR）对手术切除后的血浆cfDNA样本进行评估，以评估可切除的NSCLC患者接受治愈性治疗后ctDNA的识别和预测复发的能力。利用原发肿瘤全外显子组测序的基因组数据，使用Signatera技术为每个个体创建个性化的PCR panels，以平均每个患者18个SNV为目标，该方法检测ctDNA的灵敏度（来自体外实验）表明，在频率高于0.1的SNV中，检测ctDNA的灵敏度为99%。

本研究共纳入24例患者。所有患者均为可切除的IA-IIIB期NSCLC，其中一半患者在手术切除后接受了辅助化疗，部分患者接受了术后放疗。对术前和术后血浆标本进行ctDNA检测。如果在血浆中至少检测到两个肿瘤相关SNV，则认为ctDNA检测阳性，在775天的随访中，14例患者出现疾病复发，其中13例（93%）患者在临床复发前或临床复发时检测到ctDNA。然而，只有36%的复发患者在术后第一个时间点检测到ctDNA MRD；相比之下，90%在术后第一个时间点检测不到ctDNA MRD的患者没有出现疾病复发。有趣的是，3例术后30天内检测到ctDNA的患者接受了辅助化疗，化疗后ctDNA水平升高，并在1年内复发。在10例未复发的患者中，有3例在至少一个时间点检测到ctDNA，这些综合研究结果表明ctDNA检测在随访期间对识别疾病复发具有较高的敏感性，同时保持适度的特异性。此外，这些发现表明，ctDNA动态可能会告诉我们有关化疗耐药的信息，正如3例尽管进行了辅助化疗但ctDNA水平上升的患者所示。

2020年，TRACERx研究的最新结果在美国癌症研究协会年会上公布，78例I-III期NSCLC患者被纳入分析，使用ArcherDx技术生成患者特异性的锚定多重PCR panel，通过多区域全外显子组测序，这些检测板瞄准了原发肿瘤组织中检测到的196个克隆和亚克隆变异，45例复发，其中37例在临床复发时或复发前检测到ctDNA，78例患者中有10例在临床随访中被诊断为其他原发恶性肿瘤，血浆中未检测到ctDNA，这反映了ArcherDx肿瘤检测的特异性。

2016年11月，DYNAMIC研究（NCT02965391）一项前瞻性观察研究，开始在手术切除前招募疑似肺恶性肿瘤患者，以评估手术后ctDNA的半衰期。在多个时间点采集血浆样本:（1）术前即刻，（2）术后5分钟、30分钟和2小时，（3）术后1、3和30天；作者应用循环单分子扩增和重测序技术（cSMART）（一种基于PCR的NGS平台）检测血浆cfDNA样本，检测8个常见的NSCLC突变基因（EGFR, KRAS, ERBB2, PIK3CA,MET, TP53, ALK和RET）。

在205例入组患者中，36例（18%）在术前血浆样本中检测到ctDNA。其中26例患者可进行术后ctDNA分析，术前至术后2h采集血浆标本进行ctDNA半衰期计算，而在术后1 - 30天收集的血浆用于MRD分析。手术切除后血浆ctDNA浓度呈快速下降趋势，从术前立即到术后2小时，突变的等位基因分数从平均的2.72%下降到0.17%。ctDNA半衰期的中位数为35分钟，可检测到ctDNA的患者在术后1 - 30天的半衰期比在此时间段内无法检测到ctDNA的患者长。

在随访532天内25例可评估患者中，25例患者中有9例复发，其中4例（44%）在术后3天检测到ctDNA MRD，而16例未复发患者中有14例（88%）ctDNA MRD阴性。术后1天，ctDNA检测到的患者与未检测到的患者无复发生存率（RFS）没有差异，术后3天，ctDNA MRD检测到的患者与未检测到的患者相比，无复发生存率更短。此外，ctDNA结果在术后3- 30天没有变化，这与25例患者中的7例在3天和30天的的结果一致。最后，术后3天或30天检测到ctDNA MRD的患者在相同术后时间点的OS比ctDNA阴性的患者短。这些结果表明，早在肺癌手术后3天检测到的术后ctDNA可以根据复发风险对患者进行准确的分层，并对生存有预测作用。

虽然上述研究使用了有限的Panel进行靶向深度测序检测ctDNA MRD，Zviran等人旨在研究cfDNA的WGS是否能使早期接受手术切除的NSCLC患者的MRD检测成为可能。对肿瘤组织进行WGS测序以识别SNV，从血浆中计算累积的全基因组肿瘤信号。他们证明了通过整合10000多个SNV，当覆盖深度为20X时，血浆中ctDNA肿瘤组分检测到10^-5的概率为＞85%，当覆盖深度为50X时，检测到的概率为＞99%。通过全基因组分析，从拷贝数改变中计算肿瘤信号，并将其与检测到的SNV相结合，产生一个单一的统计检测分数，他们将这种检测方法命名为MRDetect，并在22名接受手术的肺腺癌患者队列中测试了它的应用。22例I-III期NSCLC患者术前和术后约2.5周采集血浆样本。随访中位时间为18个月，22例患者中有12例术后ctDNA MRD阴性，无复发，10例ctDNA MRD可检出的患者中，50%的患者复发。最后与ctDNA MRD阴性的患者相比，术后可检测到ctDNA MRD的患者的RFS明显更差。这些结果表明，这种肿瘤来源的血浆WGS方法可以作为早期NSCLC预后的ctDNA MRD生物标志物。

3. 正在进行的研究 

到目前为止，已有的信息证据证明ctDNA MRD可能是一种预后预测的生物标志物。不同的研究小组已经开始了前瞻性研究，评估ctDNA MRD在预测复发和个性化治疗策略方面的作用。阿斯利康与ArcherDx开展了两项合作研究:MERMAID-1和MERMAID-2。MERMAID-1 （NCT04385368）是一项用于可切除II-III期NSCLC患者的III期临床试验，ctDNA MRD阳性的患者，随机分配接受 durvalumab 辅助联合铂基类化疗药物 vs 安慰剂加铂基类化疗药物。MERMAID-2 （NCT04642469）是一项III期研究，在该研究中，接受标准手术切除的II-III期NSCLC患者在完成治疗意向治疗后进行连续长达2年ctDNA分析，如果ctDNA呈阳性，他们将被随机分配接受辅助durvalumab或安慰剂治疗长达2年。在与斯坦福大学的合作中，阿斯利康也启动了一项II期试验（NCT04585477），评估I-III期NSCLC患者的ctDNA MRD，在这项试验中使用AVENIO ctDNA监测试剂盒（CAPP-Seq技术）检测到ctDNA MRD阳性的患者，在根治性手术或立体定向体部放射治疗后，接受长达1年的durvalumab辅助治疗，而那些ctDNA MRD阴性的患者在护理标准之外不接受进一步治疗。这种类型的研究有可能提高推荐早期NSCLC患者辅助全身治疗的能力，改善目前临床上用于早期淋巴结阴性患者的4cm肿瘤大小切点。在另一项研究中使用AVENIO ctDNA检测平台（NCT04585490），ctDNA MRD阳性的不可切除III期NSCLC患者在CRT后接受杜鲁单抗加四个周期含铂双价化疗，而CRT后没有检测到ctDNA MRD的患者接受标准护理及durvalumab巩固治疗。其他前瞻性研究对收集血液样本进行ctDNA分析，作为II期和III期试验的一部分的目的是将ctDNA MRD与疗效和治疗反应相关联。在华盛顿大学，一项II期研究正在研究使用低分裂磁共振成像引导的适应性放射治疗的局部和区域控制，同时进行化疗，然后进行durvalumab巩固治疗。在本试验中，作为探索性分析的一部分，研究人员在6个时间点（处理前、处理中和连续处理后）收集血浆样本，使用CAPP-Seq进行ctDNA分析，计划研究ctDNA水平与影像学进展、无进展生存期和OS的相关性。此外，作为Checkdate-816 （NCT02998528）探索性分析的一部分，该III期试验比较了可切除的IB-IIIA期NSCLC患者新辅助尼鲁单抗加化疗与单化疗的安全性和有效性，在新辅助条件下的每个周期全身治疗前，将收集血液用于ctDNA分析。研究人员正在使用ArcherDx个性化癌症监测平台来评估ctDNA动态，这将与新辅助全身治疗的反应相关，在2021年美国癌症研究协会年会上公布了对90例患者的初步研究结果，结果表明在新辅助治疗前，有87例患者检测到了ctDNA，在nivolumab 联合化疗组中，从第1周期到第3周期清除ctDNA水平的比例为56%，而化疗组为34%。如果上述前瞻性研究证实ctDNA是治疗复发和治疗反应的预后和预测性生物标志物，在未来，根治性NSCLC患者的治疗模式可能会向ctDNA驱动的个性化治疗转变。一种可能的结果是将ctDNA MRD检测纳入标准临床实践，通过个性化辅助和巩固治疗的升级与降级来潜在地提高治愈率，同时降低毒性风险。

讨论与未来方向

尽管采用了积极的多种治疗方法，I-III期NSCLC患者在治愈性治疗后仍有较高的疾病复发率。因此，最重要的是确定哪些患者的疾病复发风险增加，并调查策略，可以减轻这种情况并提高治愈率。虽然治疗前的ctDNA水平并不总是可检测的，一些研究表明治疗前可检测的ctDNA与较差的FFP和生存率相关。这表明，在治疗意图策略前可检测到的ctDNA可能是微转移疾病的一个标记，并可能是一个有用的生物标志物，以选择患者进行新辅助治疗。

尽管ctDNA分析有可能识别患者进行个性化治疗，以最大限度地提高治愈机会，同时降低过度治疗的风险，但它在早期NSCLC患者的临床实践中应用仍存在一些主要障碍。其中一个主要问题是ctDNA检测在I期非小细胞肺癌中的敏感性较低。The Circulating Cell-free Genome Atlas（NCT02889978）研究使用cfDNA甲基化测序，然后进行机器学习，结果显示检测治疗前I期肺癌的敏感性约为24%。一种基于机器学习的ctDNA检测方法被称为Lung cancer likelihood in plasma（Lung-clip），治疗前IA期检测灵敏度为18%。Abbosh等人强调了检测早期疾病的挑战，估计检测1.2厘米大小的肺癌结节可能需要ctDNA检测下限低至百万分之20。另外一个检测可靠的ctDNA的挑战是CHIP，CHIP导致cfDNA中可检测到源自造血细胞的突变，并可导致血浆基因分型假阳性。例如癌症相关的 TP53,KRAS, JAK2, GNAS和IDH2也有可能来自CHIP。研究表明，在大约60岁的伴有低等位基因含量的CHIP相关变异的患者中，CHIP突变频率为92%。由于ctDNA检测具有更高的灵敏度和超低的检测限，因此也存在检测到更多CHIP突变的风险。从ctDNA结果中过滤CHIP变异的主要解决方案是通过对外周血单个核细胞进行与血浆cfDNA平行测序。事实上目前可用的商业ctDNA检测可能不适合在临床环境中进行MRD检测，因为CHIP的变异过滤不充分，影响了检测的特异性，以及检测限不够低不能确保高的检测灵敏度。ctDNA MRD检测的技术也会影响检测的性能，ctDNA检测可以被宽泛地归类为tumor-informed或tumor-naive。tumor-informed需要对肿瘤组织进行初始测序，以创建个性化的分析来检测血浆样本是否存在已知的突变，相比之下，tumor-naive依赖来自血浆的突变，检测开发不需要预处理肿瘤测序。与原始方法相比，tumor-informed方法的局限性包括：1）无法检测随访期间出现的克隆变异，包括导致治疗耐药性的突变。2）由于测序肿瘤材料不足，应用潜力有限。3）肿瘤异质性对偏倚试验设计和性能的潜在影响。4）由于试验个性化，增加了周期时间。5）与肿瘤组织接触相关的实际限制是患者在一种临床实践环境中诊断但在另一种环境中治疗。tumor-informed分析的优势在于血浆中检测到的突变是肿瘤特异性的，而不是人为的。使用个性化的肿瘤检测同时跟踪多种肿瘤特异性突变的能力也可以优化检测的敏感性和特异性，与现成的tumor-naive assay设计相比，增加成功的机会。未来的肺癌研究在决定使用哪种ctDNA MRD技术时，必须权衡这些实用和技术方面的考虑。该领域的另一个主要问题是缺乏关于ctDNA MRD检测最佳时间点的标准化。检测的敏感性和特异性在很大程度上取决于ctDNA是在治疗后的单个时间点进行分析，还是跨多个时间点进行整合。此外，Chen等、Abboshetal和Zviran等提供的ctDNA MRD数据是针对手术后可切除的疾病，而Chaudhuri等和Moding等分别提供的数据主要来自于化疗和放疗完成后不可切除的疾病（表1及表2）。

尽管ctDNA技术、治疗方式和分析时间点在这些研究中有所不同，但ctDNA MRD检测状态仍然具有很高的预后价值。然而根据ctDNA MRD检测状态进行个性化治疗是否能改善患者的预后仍有待证实。考虑到异质性和已发表队列的规模不大，以及预测数据的缺乏，目前尚不清楚ctDNA MRD评估的最佳治疗后时间点是什么，以便肿瘤学家决定是否提供额外的治疗。解决这个问题需要科学和商业实体的合作，类似于正在进行的晚期NSCLC Pot-ICI ctDNA数据的ctMoniTR协调工作。同样关键的是，继续进行前瞻性的临床试验工作，专门测试ctDNA MRD是否是一种稳健的预测性生物标志物（图1），其结构类似于MERMAID-1，后者正在测试肺癌手术后的ctDNA MRD检测是否可以用于个性化的辅助免疫治疗。因此，需要更多的大患者群体和多个早期治疗后时间点的研究来更好地了解ctDNA MRD及其与NSCLC复发和生存的预测相关性。 END