【关注】Focus | PROTAC，小分子药的燎原之火

来源：肽研社

前     言

  从第一个重磅炸弹药物地西泮到小分子靶向药格列卫，小分子药物从上世纪至今经历了辉煌的历史，直到近几年，受诸多不可成药靶点的限制，小分子药物开发到了瓶颈期，外加从   2014   年   PD-1   单抗上市开始，小分子药在各个适应症受到了大分子药物众多创新疗法的围剿，大分子药在其他未充分开拓的适应症领域（如各类罕见病等）更是锋芒毕露，相比之下，小分子药日渐式微。   2015   年与   2021   年的畅销药物   TOP20   中的小分子药数量占比深刻地体现了这一趋势：   2015   年   TOP20   畅销药中有   11   款小分子药，而   2021   年   TOP20   中仅剩   6   款小分子药。      

图1.2015年全球TOP20畅销药物

图2.2021年全球TOP20畅销药物

直到2015年PROTAC走进人们视野，作为一种双功能小分子，PROTAC可以利用泛素-蛋白酶系统（UPS）靶向调控致病蛋白的降解，在攻克不可成药的靶点和耐药问题上有极大的潜力。自2001年首个PROTAC分子被设计出以后，二十年来在肿瘤等疾病领域的研究进展突飞猛进，受到了产业界和资本圈的热捧。     PROTAC为小分子药点燃了一把燎原之火，期待未来能掀起小分子药物新的浪潮~    

图3.PROTAC的研究历史

靶向蛋白降解技术

靶向蛋白降解 (TPD) 是指使PROTAC等降解剂敲降细胞内的靶标蛋白，这些降解剂利用泛素-蛋白酶体系统来敲降靶蛋白，这是一种细胞内质量控制机制，利用E3泛素连接酶和相关部位寻找受损或折叠错误的蛋白，由蛋白酶体降解。除了PROTAC以外，可以靶向降解蛋白的还有分子胶、LYTAC、ATAC等降解剂，本文主要针对PROTAC进行研究，其他几项技术后续再进行详解~

图4.PROTAC的SWO分析

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PROTAC是什么？

PROTAC（proteolysis targeting chimera，蛋白降解靶向嵌合体）是一种利用UPS系统对靶蛋白进行降解的药物开发技术，结构上，PROTAC包括三部分：一个是泛素连接酶E3配体，另一个是靶蛋白配体，两个配体之间通过Linker结构相连，从而形成靶蛋白配体-Linker-E3三元复合物。

图5.PROTAC三元复合结构

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PROTAC作用机制

细胞内蛋白质降解有2条途径：1）泛素-蛋白酶体系统（UPS），2）自噬/ 溶酶体，其中，UPS是真核细胞中一种高度保守的机制，用于正常和错误折叠的蛋白质降解，保持细胞内蛋白质稳态。在UPS中，需要降解的蛋白质首先被泛素共价标记，标记过程由泛素活化酶(E1)、泛素结合酶(E2)和泛素连接酶(E3)三种酶催化。游离泛素被E1激活并通过ATP依赖性的反应连接到E1的半胱氨酸残基(Cys)上形成硫酯键；泛素标记的E1通过转硫酯化反应将泛素转移到E2的Cys上；E3将结合与E2上的泛素转移到目标底物的赖氨酸残基(Lys)上，实现目标蛋白的泛素化标记。这种重复的泛素化过程会在目标蛋白上标记一条poly-Ub链(主要通过泛素的Lys48连接)，26S蛋白酶体将识别泛素标记的底物并将其降解。在人类蛋白质组中，有两种E1，大约40种E2和600多种E3，其中E3连接酶负责特异性识别底物。

图6.泛素化过程

在人体内， PROTAC 利用 UPS 系统将靶蛋白降解，降解过程大致包括：靶蛋白配体与靶蛋白（ POI ）结合， E3 泛素连接酶配体与细胞内的 E3 泛素连接酶底物结合区结合， Linker 则使靶蛋白与 E3 泛素连接酶拉近，从而使 E3 泛素连接酶利用泛素将靶蛋白标记为缺陷或受损蛋白，最终达到靶蛋白被蛋白酶降解清除的目的。

图7.PROTAC作用机制

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PROTAC的设计

上文写到 PROTAC 是一个由泛素连接酶 E3 配体、靶蛋白配体及两个配体之间的 Linker 结构组成的三元复合结构，所以在设计 PROTAC 时这三个结构应该分别进行思考。 1）E3连接酶配体 对于E3连接酶配体的研究相对较少，E3连接酶配体目前最常规的是CRBN和VHL两类。根据产业界的研究来看，E3配体的选择更多是考虑经济以及成药性。 从下图中可以看出，目前已发现的几类E3连接酶靶向的多数是经确认可降解的靶点，对于小分子药不可成药及未确认可降解的靶点的研究还比较缺乏~

图8.常见E3连接酶配体及癌种

2）靶蛋白配体

在设计PROTAC分子时，通常会先选择好靶蛋白再进行靶蛋白配体的设计，对于靶蛋白的挑选主要从以下三个方面考虑：

特异性较强；PROTAC的常规降解蛋白；有报道过相关的配体或晶型 实际设计中，往往还会遇到靶蛋白本身的内源性配体：多肽、 DNA 、糖链等，所以在研究过程中结合腔、突变、其它变构位点、可逆共价结合等种种因素都需要考虑。 3）Linker

早期PROTAC研究中会选择PEG链作为连接分子，因为PRG链柔性较好。但也正因为PEG的柔性较高，导致分子结合熵过高，在后期研究中需要进行优化。

目前关于Linker的研究尚未形成成熟的体系，大多数Linker链长通常在10~20个原子长度，从下图中可以看出，较长的链长由于更高的熵而使活性降低，但能够更有效拉近配体两端分子距离。所以现阶段PROTAC分子设计一般会选择稍长的 Linker链。

图9.Linker链长与活性的关系（Bemis等人的研究）

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PROTAC靶点

学术界和产业界对于PROTAC的研究越来越广泛和深入，研究时通常倾向于将激酶作为靶点，可被PROTAC降解的靶点也逐渐被发现，如BRD4、RIPK2、TBK1、Sirt2、CDK、Pirin、c－Met、EGFR、FAK、FLT3等靶点。目前已被发现的激酶共518种，根据其结构和功能被分为9类（图7），而目前已确认的PROTAC靶点仅有131个（图8），其中有多数是传统小分子抑制剂的成熟靶点，这意味着有大量小分子药物未成药的新靶点还有待研究。

图10.人体激酶图谱（标红为可降解的激酶）

图11.针对不同疾病的PROTAC靶点（左）可降解激酶的分类及靶点分布（右）

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PROTAC的优势

PROTAC分子的“事件驱动”结合模式使其与靶蛋白只需要弱结合即可调控靶蛋白降解，有助于攻克小分子难以成药的靶点；另外PROTAC发挥作用时直接将靶蛋白降解，克服了传统小分子药物容易导致的靶蛋白过表达及突变等耐药性问题；由于PROTAC的生效机制类似催化反应，因此只需要极低剂量即可发挥效用，较低的给药浓度使PROTAC药物的安全性较高。

图13.PROTAC与传统小分子药物的区别

1）攻克难以成药靶点

传统小分子抑制剂采用的是“占位驱动“模式，药物分子需要和靶蛋白的活性部位紧密结合，从而抑制靶蛋白的活性，达到一定的药理作用。PROTAC与传统抑制剂不同，采用的是“事件驱动”模式，可以和靶蛋白的任何位置结合，且不需要高亲和力，就可能诱导靶蛋白降解。因此PROTAC可以靶向表面光滑缺乏小分子结合区域的蛋白，人类细胞中80%的致病蛋白缺乏可供传统小分子结合的活性位点，这意味着很多小分子无法成药的靶点有很大可能被PROTAC技术攻克。

图14.事件驱动模式（A）占位驱动模式（B）

2）剂量小、安全性高 PROTAC的反应过程类似催化反应，在引发靶蛋白降解后，E3- PROTAC-靶蛋白三元复合物 自身会解离进入下一催化循环，药物可重复利用  ，因此只需要催化剂量的药物，较低的药物浓度降低了毒副作用，结合“4）特异性强”，使PROTAC的安全性大幅提升。 3）克服耐药性 传统小分子药物作用于靶蛋白时，高亲和性的结合可能造成靶蛋白突变或过表达，进而产生耐药性。而 PROTAC 分子通过 UPS 将靶蛋白降解掉，在克服耐药性环节上有很大突破。 4）特异性强 传统小分子药物结构相对较小，因而可能靶向多个蛋白，脱靶毒性是众多小分子不得不面对的一大难题；而 PROTAC 分子由于 E3 泛素连接酶与靶蛋白之间的协同作用，使其特异性大幅增强，降低脱靶毒性从而提高安全性。 5）快速可逆的化学敲降

利用PROTAC建立蛋白敲降 动物模型可以作为研究靶标基因功能序列丢失的有力补充手段。传统遗传性方法是通过基因改造来建立动物模型，例如，应用TALEN或CRISPR-Cas9等基因编辑技术。然而这些技术通常难以达到快速可逆的效果，且其长周期、高费用的特点给研究带来更多挑战。作为一种新型蛋白敲降模型，PROTAC可以作为现有遗传性工具的一种有效补充手段~

图15.PROTAC构建蛋白敲降模型

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开发难点

尽管PROTAC相比于传统小分子药物有极大的优势，但在药物开发时仍有许多难题尚未解决，如分子量大导致膜透性差以及口服利用度差，成药难度较高；目前PROTAC的研究大多数是过去开发小分子药物的经验性研究，多数靶点是对传统小分子靶点的验证，新靶点和新E3配体的发现难度较大；三元复合结构特有的hook effect对于PROTAC分子的浓度要求也比较苛刻，为了形成有效的三元复合结构需要探索最佳的分子浓度；此外对于最早发现的E3连接酶CRBN，是依靠度胺类药物，而度胺类药物曾经的生殖毒性问题没有人会忘记，所以该类PROTAC的安全性评价需要更谨慎。   1）成药性问题 作为双功能分子，PROTAC分子量大多数在1000Da以上，相比于常规小分子药物的分子量要大很多，这意味着PROTAC药物的膜透性和口服利用度相对较差，导致较难成药。 研究人员已开发了多种用于提高PROTAC渗透性的策略，常见的方法是将其分子量限制在1000Da以下或将分子拆分成两个较小的前体并在细胞中结合为成熟的CLIPTAC。CLIPTAC设计利用了化学生物学中的一个常见点击反应，即反式烯与四嗪的所谓反向电子需求Diels-Alder反应。这个反应与生成三氮唑的经典点击反应类似，只有这两个官能团之间能高效率反应、而与其它活性基团没什么交叉反应，所以特异性很高。因为PROTAC被一分为二，所以每一部分进入细胞都比较容易。进入细胞后烈火干柴形成PROTAC，降解目标蛋白。

图16.基于CRBN的CLIPAC原理

此外，可以引入长的柔性连接片段形成分子内氢键以降低部分极性，或将细胞渗透性肽连接到 E3 配体上，进而增加 PROTAC 的细胞渗透性。除了修饰 PROTAC 本身，应用脂质体等纳米颗粒来递送 PROTAC 也可以显著增强 PROTAC 的细胞摄取。 2）E3配体的筛选 PROTAC的设计需要已知的POI/E3配体作为蛋白质诱饵，因此PROTAC的开发很大程度上取决于这些配体的发现和优化。此外，一些已知POI/E3配体的特异性较差，容易产生脱靶效应。因此，发现高特异性的POI/E3配体对于开发PROTAC至关重要。 PROTAC从2001年被提出至今，限制成药的主要原因之一就是缺少可用的E3连接酶配体，E3泛素连接酶总共有600多个，但只有不到10个被开发用于靶向蛋白质降解。其中，靶向CBRN的研究占多数，另外比较常用的还有VHL、IAPs和MDM2。现在PROTAC药物的设计主要依赖于VHL和CRBN等几类E3，由此会带来耐药和降解新底物（neo-substrate）引起的毒性的问题，因此寻找新的E3连接酶，是目前产业界和学术界的主要研究方向。 3）毒性问题 2010年，日本学者揭示度胺类药物（沙利度胺、来那度胺、泊马度胺）能靶向E3酶CRBN，人们可直接用度胺类的骨架作为结合E3连接酶的配体。然而沙利度胺上世纪让人闻风丧胆的生殖毒性一直没有被人们忘记，所以对靶向CRBN的PROTAC药物的毒性评价会更加全面。 4）Hook effect钩子效应 需要形成三元复合物来发挥作用的分子，基本都会牵涉到Hook effect，比如PROTAC，双抗等。有效形成三元复合物的同时有效激活降解系统，PROTAC发挥药效必须与靶蛋白和E3酶形成有效的三元复合物，而此过程对PROTAC来说，如何控制浓度以避免药物分子与靶蛋白和E3酶分别形成hook effect是一个非常重要的目标。

图17.给药浓度与Hook effect形成相关性 2017 年 Gadd 等人研究发现，通过改善协同结合的 PPIs 可以降低 Hook effect ，在三元复合物中具有显著正合作关系的 BTK 靶向 PROTAC 在 2.5 pM 以下没有表现出明显的 Hook effect 。这意味着增加协同结合 PPIs 来稳定三元复合物是降低 Hook effect 的一种策略。

资本热度及全球研发进展

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PROTAC资本热度情况

根据医药魔方数据， 2021 年全球开发新技术和新疗法的公司有超过 800 家公布了融资事件，其中传统小分子药物、细胞疗法和单抗领域的公司融资事件最多，可以看出研发热门仍聚焦在这几个研究领域，从图中可以看出蛋白降解剂领域融资的公司数量（ 20 家）不算多，但是考虑到目前 PROTAC 仍处于研发早期探索阶段，产业界和资本圈已经越发注重蛋白降解领域的布局，未来随着新靶点和新的技术被发现， PROTAC 领域有望加速发展。

图18.2021年全球新疗法融资情况

下图可以看出，从融资的公司数量角度，国内2021年PROTAC融资事件共10起，占全球总共PROTAC融资事件接近50%；不过从融资进度看，国内公司相对来说还是处于早期居多，相比国外落后一些。结合下文全球pipeline中国公司的在研项目，可以看出国内的Biotech公司在前沿生物技术上的布局正在逐渐缩小与全球的距离。从PROTAC开始，国内药企在小分子药物领域或许有弯道超车的机会~

图19.2021年PROTAC蛋白降解领域融资事件

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全球PROTAC药物研发进展

2015 年，自 Crews 团队发现了第二个 E3 连接酶 VHL 以后， PROTAC 的研究数量开始突飞猛进。

图20.2008~2021年PROTAC研究数量

根据医药魔方数据，目前全球尚未有 PROTAC 药物获批上市，共有 17 款药物在临床阶段，其中进展最快的是 3 个临床 I/II 期项目（ 2 款属于 Arvians ， 1 款属于 C4 Therapeutics ）， 14 个临床 I 期项目；另外有 147 款临床前阶段项目，其中 2 款正在 IND ， 145 款正在进行临床前研究。

图21.全球PROTAC药物在研进展

图22.全球临床阶段PROTAC分子

从靶点来看，靶向编码雄激素受体基因的AR激酶的临床研究数目最多，小分子抑制剂中较为成熟的BTK、ALK、EGFR等靶点也有很多研究项目。

图23.全球热门靶点临床研究分布

明星企业 

在  PROTAC  领域，最知名的公司是第一家布局该领域的公司  Arvinas  ，由设计出第一个  PROTAC  分子的  Crews  教授创办，也是全球唯一一家有两款进入临床  II  期的  PROTAC  药物的公司（共  3  款药物进入临床  II  期），此外，  C4 Therapeutics  、  Kymera  、  Nurix Therapeutics  也是紧跟  Arvinas  脚步布局  PROTAC  的明星公司，国内进展较快的公司有百济神州、海创药业、开拓药业和海思科等公司。其中布局较早的  Arvinas  和  C4 Therapeutics  更是获得跨国巨头的青睐，频频下重筹押注  PROTAC  赛道，这从侧面体现了  PROTAC  在临床应用上的价值  ~  

图24.全球布局PROTAC药物的公司情况

可以明显看出，以Arvinas和C4 Therapeutics的临床进展最快，可以归为第一梯队；其后百济神州、Kymera、Nurix及Accutar等PROTAC药物进入pahse I的企业临床进度稍慢，可以归为第二梯队；其他布局PROTAC药物较晚的公司暂列第三梯队。但是随着PROTAC领域众多药物纷纷进入I期公布临床数据后，对于公司的排位又会是一次大浪淘沙式地洗牌~

图25.PROTAC药物企业图谱

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Arvinas

Arvinas  是  PROTAC  发现者  Crews  教授在  2013  年创建，从创立伊始公司的研究领域就锁定在  PROTAC  上，是现在全球  PROTAC  药物临床进展最快的公司。  2018  年  Arvinas  在  NASDAQ  上市，股价最高时  $108.47  ，较发行价增长了  416.5%  。   Arvinas在PROTAC领域进展最快的两款药物是ARV-110和ARV-471，并且与Pfizer、MSD、Genetech等跨国巨头在管线中的PROTAC药物上建立了合作关系。 ARV-110的靶点是雄激素受体AR，主要研究针对转移性去势抵抗性前列腺癌（CRPC）的治疗效果，根据2022年2月公布的最新临床数据显示：携带AR T878X/H875Y突变肿瘤患者的PSA50率为46%（n=26），在7例携带AR T878X/H875Y突变肿瘤的RECIST可评估患者中，2例获得确认的部分缓解，在预治疗次数较少（既往仅接受过一种新型激素药物治疗，既往未接受过化疗）的亚组中可评估患者的PSA50率为26%（5/19），在2期临床试验推荐剂量（RP2D）420 mg下，ARV-110的耐受性可控。大多数治疗相关不良事件（TRAE）为1/2级，在接受RP2D治疗的113例患者中未发生≥4级TRAE。 ARV-471则是靶向雌激素受体ER，并且是治疗乳腺癌的潜在BIC药物，根据此前临床数据，ARV-471能够显著降低患者肿瘤组织中的ER表达水平，平均将ER水平降低62%，最多降低接近90%。14例可评估的患者中，1例患者达到确认的部分缓解，肿瘤病灶缩小51%。两例患者达到未确认的部分缓解，还有1例患者疾病稳定并且病灶缩小50%以上。 2021年7月22日，Pfizer与Arvinas达成协议，共同开发并商业化ER降解剂ARV-471。根据协议，Pfizer将向 Arvinas支付$650Mn的预付款，以及$350Mn的股权投资，获得7%的股份。除了在全球范围内分享ARV-471的利润外，Arvinas还有资格获得$400Mn的批准里程碑和$1Bn的商业里程碑付款。

图26.Arvinas pipeline

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C4 Therapeutics

C4 Therapeutics成立于2015年，自主开发了PROTAC技术平台Degronimid。从pipeline来看，C4 Therapeutics是PROTAC领域中研发进展第二快的公司，CFT7455是全球范围内第三款进入临床II期研究的PROTAC药物。    CFT7455是一款靶向IKZF1/3的PROTAC药物， 2021年6月，开始针对多发性骨髓瘤的临床I/II期研究，旨在评估CFT7455对多发性骨髓瘤患者的安全性、耐受性和抗肿瘤活性。在临床I期研究中，当CFT7455在ALCL的KiJK细胞系中给药6小时后，IKZF1蛋白水平降低了89%。此外，人们发现CFT7455在具有MYC、BCL2和BCL6易位或重排的非霍奇金淋巴瘤细胞系中具有很强的抗增殖活性。在非霍奇金淋巴瘤的异种移植模型中，与现有的免疫调节药物相比，CFT7455在体内具有强大疗效，其中包括ALCL、弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）和套细胞淋巴瘤（MCL）模型中持久的肿瘤消退。 值得一提的是，C4 Therapeutics与Roche、Biogen以及 Alphabet的子公司Calico建立了深度合作关系。在成立初期就已经与Roche建立了合作关系，签下了$750Mn的大单。2019年，C4 Therapeutics 与Biogen宣布合作关系，双方将共同致力于潜在的神经退行性疾病新疗法的治疗（如阿尔茨海默氏症和帕金森氏症），在这项合作中，C4 Therapeutics 获得了高达$415Mn的预付款；2019年，C4 Therapeutics再次宣布更新与Roche的合作条款，将为罗氏开发基于靶向蛋白降解的抗癌新药。    

图27.C4 Therapeutics pipeline

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海创药业

海创药业成立于  2012  年，专注研究  PROTAC  领域和氘代药物研发。拥有  PROTAC   靶向蛋白降解技术平台、氘代药物研发平台、靶向药物发现与验证平台及先导化合物优化筛选平台四大技术平台。海创药业于  2022  年  4  月在  A  股科创板上市。      在pipeline中，海创药业的HP518的研发进展在全球PROTAC药物中位居前列，目前处于临床I期。HP518与ARV-110一样，靶向雄激素受体AR，是一款治疗前列腺癌的口服PROTAC药物，在临床前研究中，HP518展示出良好的口服生物利用度，在前列腺癌动物模型研究中显示了良好的抗肿瘤活性。根据已发表的数据，HP518的体外生物活性、药效与Arvinas的ARV-110相当，且没有ARV-110与他汀类药物相互作用的问题，预计HP518有更好的安全性、更广的患者人群和适用范围。

图28.海创药业pipeline

结语 

PROTAC  因为有突破传统小分子药物不可成药瓶颈的可能性，在发现  20  多年来不断改进和完善，逐渐接近临床应用，一步步缩小与患者的距离。虽然  PROTAC  在治疗上有很大潜力，但目前随着资本的热捧，越来越多重复的靶点开始得到验证并涌入临床，对于大量传统小分子药无法成药的靶点反而缺少研究，在  PROTAC  药物的开发上，仍有诸多问题等待解决。不过我们相信随着资本圈和产业界共同努力，未来对于  PROTAC  的研究热度会不断升温，一定会有新的技术将现在的难题一一破解，真正将  PROTAC  药物作用到患者体内  ~   引用资料

[1] 药智网

[2] China Biotechnology

[3] 知乎

[4] Clinical trials

[5] 药融云

[6] Wikipedia

[7] 药渡

[8] 雪球

[9] Wind

[10] Arvinas官网

[11] 海创药业官网

[12] C4 Therapeutics官网

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[16] Ghidini, A., Cléry, A., Halloy, F., Allain, F. H. T. & Hall, J. RNA-PROTACs:degraders of RNA-binding. proteins Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 60, 3163–3169(2021).

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