科研丨Nature子刊: 微生物酶通过重新激活小鼠胃肠道中的三氯生来诱发结肠炎(国人佳作)

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编译：微科盟听雪斋，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读  

三氯生(TCS)是一种在数千种消费品中被发现的抗菌剂，新兴研究支持三氯生(TCS)在动物模型中会加剧结肠炎和结肠炎相关的结直肠肿瘤发生。虽然TCS的肠道毒性需要肠道微生物群的存在，但所涉及的分子机制尚未明确。本研究表明肠道共生微生物介导结肠中TCS的代谢激活并驱动其肠道毒理学。通过一系列体外、离体和体内方法，我们确定了所涉及的特定微生物β-葡萄糖醛酸酶(GUS)，并确定了在肠道中代谢激活TCS所需的分子基序。最后，我们表明靶向抑制细菌GUS酶可消除TCS的促结肠炎作用，支持特定微生物蛋白在TCS毒性中发挥重要作用。综上，我们的研究结果定义了肠道微生物促进TCS代谢激活和肠道毒性的机制，并强调了在评估环境化学物质的毒性潜力时考虑肠道微生物的贡献的重要性。

论文ID

原名：Microbial enzymes induce colitis by reactivating triclosan in the mouse gastrointestinal tract

译名：微生物酶通过重新激活小鼠胃肠道中的三氯生来诱发结肠炎

期刊：Nature Communications

IF：17.694

发表时间：2022.1

通讯作者：蔡宗苇，Matthew R. Redinbo，Guodong Zhang

通讯作者单位：香港浸会大学；美国北卡罗来纳大学教堂山分校；美国马萨诸塞大学

DOI号：   10.1038/s41467-021-27762-y  

实验设计

结果

1 小鼠肠道中独特的TCS代谢谱 本研究首先试图确定下消化道是否表现出与其他组织不同的TCS代谢特征。我们通过饮食用80 ppm TCS处理小鼠4周，然后使用LC-MS/MS分析一系列小鼠组织中的TCS及其代谢物浓度。根据我们之前的研究确定了TCS治疗方案来模拟人类暴露于TCS的情况。我们发现，在TCS暴露后，在肝脏、胆汁、心脏和小肠中发现的主要TCS化合物是无生物活性的共轭代谢物TCS-G。相比之下，小鼠盲肠和结肠以游离TCS为主。在小鼠小肠第4段食糜中发现的TCS代谢物为36.9%游离TCS、55.4%TCS-G和7.7%硫酸结合TCS(TCS-硫酸盐)；而粪便中含有99.1%游离TCS，只有0.7%TCS-G和0.2%TCS-硫酸盐(图1a)。这些结果表明，与其他组织相比，结肠具有独特的TCS代谢特征，并且独特地含有几乎普遍存在的游离TCS。 为了进一步验证这一发现，我们用较低剂量的TCS治疗小鼠并分析其在结肠组织中的代谢特征。我们通过饮食给予1、10和80 ppm的TCS处理小鼠4周，发现在所有测试剂量下，肠道组织具有相似的TCS代谢特征，并且以大量游离TCS为特征：结肠食糜、盲肠食糜和粪便中检测到的~94-100%的TCS种类以游离TCS的形式存在(图1b)；而在其他地方观察到TCS及其代谢物的混合物(补充图S1)。此外，LC-MS/MS显示TCS暴露对TCS肠道浓度的剂量依赖性效应：饲粮中添加1、10和80 ppm TCS后，结肠食糜中游离TCS浓度分别为1.5、14.7和92.2 pmol/mg组织(图1b)。这些发现进一步支持结肠具有独特的TCS代谢谱，并含有大量的游离TCS。

图1. 小鼠和人类的TCS暴露导致结肠中游离TCS的积累。a通过饮食用80 ppm TCS处理小鼠4周后，盲肠食糜和粪便内容物显示出高水平的游离TCS，而在其他地方观察到TCS和代谢物的混合物(每组n=10只小鼠)。b通过饮食给予1、10和80 ppm的TCS治疗小鼠4周。在所有测试剂量下，包括粪便、结肠食糜和盲肠食糜在内的肠道组织均表现出高水平的游离TCS和低水平的代谢物(每组n=7-8只小鼠)。c洗脱期后，人类受试者使用个人护理产品(含或不含TCS)长达4个月。收集了23个粪便样本，但仅收集了7个尿液样本。d TCS暴露人类受试者粪便样本中的主要化合物是游离TCS(n=23)，而TCS暴露人类受试者尿液样本中的主要化合物是TCS-G(n=7)。数据为平均值±SEM。缩写：TCS：三氯生，TCS-G：三氯生-葡糖苷酸，TCS-sulfate：三氯生-硫酸盐。 2 人体肠道中独特的TCS代谢谱 为了拓宽我们对肠道中TCS代谢谱的理解，我们接下来分析了人类受试者的TCS代谢。我们使用了之前一项研究的尿液和粪便样本，在该研究中，招募的人类受试者首先经历了一个洗脱期(不使用含有TCS的产品)，然后被随机分为两组，分别使用个人护理产品，如含或不含TCS的牙膏长达4个月(参见图1c中的实验方案)。先前的数据已经确定，人类主要通过牙膏直接通过口腔进入胃肠道而接触到TCS。 首先，我们测试了在使用含TCS的产品后，是否可以在粪便或尿液样本中检测到TCS及其代谢物。正如预期的那样，在清除期之后，我们发现大多数人类受试者在研究开始时的TCS水平非常低(t=0)；尽管有两名受试者(一名在对照组，一名在TCS组)即使在t=0时也显示出可检测的TCS水平(补充图S2a)，这可能是由于TCS在环境中普遍存在的性质。LC-MS/MS显示，即使在使用含TCS产品1个月后，在TCS暴露受试者的尿液和粪便样本中也检测到TCS及其代谢物，但在使用不含TCS产品的对照受试者中未检测到。 接下来，我们分析了暴露于TCS的人类受试者中TCS的代谢特征。LC-MS/MS显示，在所有测试的TCS暴露受试者中，粪便样本中的主要化合物是游离TCS，而尿液样本中的主要化合物是TCS-G(图1d)。人粪便中TCS、TCS-G和TCS-硫酸盐的平均摩尔浓度比为99.2%:0.8%:0.0%，而尿液中为1.6%:98.4%:0.0%(图1d和补充图S2b，C)。在粪便中测得的游离TCS浓度很高，最高可达~1 pmol/mg组织，相当于~1 µM。相比之下，尿液中的TCS浓度在低nM范围内(补充表S1和S2)。总之，这些结果表明，与尿液中发现的相比，人类肠道表现出独特的TCS代谢特征，并且含有大量的游离TCS。 3 肠道菌群在体外和体内将结肠中的TCS-G转化为TCS 上述数据显示，从肠道的近端到远端区域，TCS的浓度增加，而TCS-G的浓度降低(图1a)。因此，我们假设肠道微生物群参与TCS-G向TCS的转化，导致TCS在下消化道中的积累(参见补充图S3中的方案)。为了验证这一假设，我们使用了多种方法，包括肠道细菌的体外培养、抗生素介导的体内肠道细菌抑制和无菌小鼠，以检查肠道微生物群在TCS结肠代谢中的作用。 首先，我们在厌氧条件下培养肠道细菌，并测试培养的细菌是否可以在体外将TCS-G转化为TCS。我们发现来自小鼠和人类的粪便细菌能够以显著高于对照的水平催化TCS-G向TCS的转化(图2a)。这些结果支持了厌氧培养的肠道细菌可以催化TCS-G去葡萄糖醛酸化产生TCS的结论。 接下来，为了测试肠道微生物群是否参与体内结肠中TCS-G向TCS的转化，我们检查了肠道细菌的抗生素抑制是否会改变结肠食糜中TCS与TCS-G的浓度(参见图2b中的实验)。我们使用了以前研究中的抗生素混合物，表明这种混合物有效地减少了小鼠的肠道细菌。为了进一步验证这一点，我们使用16S rRNA基因作为标记分析了总粪便微生物生物量。与我们和其他人之前的研究一致，所使用的抗生素混合物导致小鼠粪便细菌显著减少(补充图S4)。接下来，LC-MS/MS研究表明，抗生素处理显著降低了游离TCS的浓度，同时使粪便中TCS-G的浓度增加了六倍(图2c)。这些结果支持肠道细菌有助于体内TCS-G向TCS转化的结论。 为了进一步检查肠道细菌在TCS结肠代谢中的作用，我们测试了抗生素作用的时间依赖性。用或不用抗生素混合物对小鼠进行预处理，然后一次性口服灌胃TCS，然后在t=4、8、12和24 h时检查TCS的代谢特征(参见图2d中的实验)。我们发现肠道细菌的抗生素抑制以时间依赖性方式降低了小鼠结肠食糜中的TCS，增加了TCS-G。曲线下面积(AUC)分析显示，在24 h内，抗生素处理使TCS降低了约40%，而结肠食糜中的TCS-G增加了约200倍(图2e、f)。这一发现与上述结果一致(图2c)，进一步支持了肠道细菌有助于结肠中TCS-G转化为TCS的结论。 最后，我们使用无菌小鼠模型进一步检查肠道微生物群在TCS结肠代谢中的作用。我们通过一次性灌胃TCS对常规小鼠或无菌小鼠(建立在C57BL/6背景下)进行TCS治疗，然后分析t=4和8 h时结肠TCS代谢谱(参见实验方案图2g)。4 h和8 h的时间点是根据我们上面的时间进程研究确定的(图2d-f)。与常规小鼠相比，无菌小鼠在其结肠食糜中表现出TCS减少和TCS-G增加(图2h)，与抗生素实验的结果一致(图2b-f)。为了进一步验证这一发现，我们比较了不同品系Swiss Webster无菌小鼠和常规小鼠的TCS结肠代谢。与常规动物相比，无菌Swiss Webster小鼠结肠食糜中TCS浓度降低，而TCS-G浓度增加(补充图S5)。我们观察到无菌小鼠结肠中存在游离TCS(图2h)，这可能来自从食物中摄入的TCS：在小鼠暴露于饮食80 ppm TCS后，在小肠食糜中检测到游离TCS，部分摄入的TCS在小肠中保持不变(图1a)。这种情况也可能发生在无菌小鼠中，小肠中的游离TCS会随着食糜的流动进入结肠。总之，粪便细菌的体外培养研究、抗生素介导的体内肠道细菌抑制和无菌小鼠模型的结果支持了共生微生物在结肠中将TCS-G转化为TCS的结论。

图2. 肠道细菌在体外和体内将TCS-G转化为TCS。a来自小鼠和人类的粪便细菌在体外将TCS-G转化为TCS(每组n=3)。b C57BL/6小鼠通过饮食摄入80 ppm TCS，在饮用水中加入或不加入抗生素混合物，持续4周。c抗生素治疗降低了小鼠粪便中的TCS并增加了TCS-G含量(每组n=10只小鼠)。d C57BL/6小鼠用或不用抗生素预处理7天，然后一次性口服管饲8 mg/kg TCS。e、f抗生素治疗以时间依赖性方式降低小鼠结肠食糜中的TCS，增加TCS-G。左：结肠食糜的时程变化(每个时间点每组n=5只小鼠)。右图：曲线下面积(AUC)分析。g常规或无菌C57BL/6小鼠接受一次性口服管饲8 mg/kg TCS。h与传统小鼠相比，无菌小鼠结肠食糜中的TCS降低，TCS-G升高(每个时间点每组n=5只小鼠)。数据为平均值±SEM。两组比较采用Shapiro-Wilk检验验证数据的正态性；当数据呈正态分布时，采用双侧t检验确定统计显著性；否则，显著性采用Wilcoxon-Mann-Whitney检验确定。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

4 特定肠道微生物β-葡萄糖醛酸酶(GUS)同源物将TCS-G转化为TCS 接下来，我们试图将特定的肠道微生物酶与TCS-G转化为TCS联系起来。由于肠道β-葡萄糖醛酸酶(GUS)已被证明可将多种葡萄糖醛酸代谢物转化为其相应的糖苷配基，因此我们假设肠道微生物GUS同源物会催化TSC-G转化为TCS。人类和小鼠肠道微生物组已被证明含有数百种独特的肠道微生物GUS酶，它们对不同的葡糖苷酸表现出不同的底物特异性。先前的研究表明，微生物GUS酶可以根据活性位点结构和/或辅因子结合分为七个不同的进化枝。我们创建了一组32种纯化的肠道微生物GUS酶，代表七个进化枝，用于体外酶筛选。我们首先使用耦合测定筛选了该组的TCS-G切割活性，发现Loop 1和黄素单核苷酸(FMN)结合的GUS同源物在利用该底物方面最有效(图3a)。然后，我们通过高效液相色谱法(HPLC)确定了TCS-G到TCS转化的催化效率，选取了12种GUS酶，集中在Loop 1和FMN结合同源物上。与耦合测定的结果一致，更严格的催化效率值表明，特定的Loop 1和FMN结合GUSs在体外将TCS-G转化为TCS最有效(图3b)。

接下来，我们采用了最近开发的基于活性探针的蛋白质组学方法来提供能够处理TCS-G的肠道微生物GUS酶的正交测量。首先，我们检测了人类粪便从TCS-G激活TCS的能力。从三名女性和三名男性供体的粪便样本中提取蛋白质。所得混合物的TCS-G转化率显示所有样品都进行了反应，转化率变化超过三倍(图3c)。接下来，确定每个样品中GUS酶的组成，从而富集GUS蛋白，并对其进行蛋白质组学鉴定和定量。GUS总丰度与TCS-G转化率相关(R2=0.60；图3d)，Loop 1 GUS丰度也是如此(R2=0.74)，而检测到的其他形式GUS的丰度没有表现出与TCS激活的相关性，包括FMN结合的GUS酶丰度(图3e)。每个粪便样本的相对GUS组成表明，它们都含有Loop 1 GUS酶，其丰度与TCS-G转换相关性最强(图3e)。综上所述，体外活性和偶联的蛋白质组学数据支持这样的结论，即肠道微生物Loop 1 GUS酶似乎是TCS-G加工的重要驱动因素。

图3. 特定的肠道微生物GUS酶将TCS-G转化为TCS。a 使用耦合分析筛选一组代表七个结构进化枝的32种纯化的肠道微生物GUS蛋白，发现Loop 1和FMN结合的GUS同源物在体外有效地将TCS-G转化为TCS。b 通过HPLC测定的催化效率值进一步表明，Loop 1和FMN结合的GUS同源物在体外显示出不同的TCS-G到TCS转化率。c 从人类粪便样本中提取的酶在体外表现出可变的TCS-G到TCS转化率。d 通过基于活性探针的蛋白质组学检测到的人类粪便样本中总细菌GUS酶的丰度与TCS-G转换率相关。e 通过基于活性探针的蛋白质组学在人类粪便样本中鉴定出的Loop 1 GUS蛋白丰度与TCS-G转化率相关，但其他类型的GUS蛋白则不相关。f F. prausnitzii 2-L1(Fp2-L1)GUS的晶体结构。g TCS-G与Fp2-L1 GUS的活性位点对接，选择用于诱变研究的残基以青色突出显示。h 野生型(WT)和Fp2-L1 GUS突变蛋白的催化效率值。i 结合FMN的Rh3 GUS二聚体(绿色，灰色)晶体结构(以蓝色突出显示)。j Rh3 GUS突变体的催化效率值表明，C端结构域、Y430和F406对于TCS-G加工很重要。数据是平均值±SEM，n=3个生物学重复。所有统计数据均使用Tukey多重比较检验的单因素方差分析。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。TCS，三氯生；TCS-G，三氯生-葡糖苷酸，GUS，β-葡萄糖醛酸酶。

5 肠道微生物GUS酶加工TCS-G需要独特的结构基序 接下来，我们检查了Loop 1肠道微生物GUS酶高效切割TCS-G的结构基础。我们集中于F. prausnitzii 2-L1(Fp2-L1)GUS，这是从我们的体外酶测定中鉴定出的最活跃的Loop 1 GUS蛋白(图3a，b)。测定了Fp2-L1 GUS的晶体结构并细化至2.2Å分辨率(补充表S3)。结果显示，在每个活性位点中，一个含有GUS抑制剂UNC10201652(GUSi)的蛋白质四聚体与葡萄糖醛酸共价连接(图3f)。Fp2-L1 GUS在GUSi和报告底物对硝基苯基葡萄糖醛酸存在下结晶。GUSi已被证明可以拦截GUS催化循环，并产生此处观察到的共价GUSi-葡萄糖醛酸加合物。GUSi采用了与之前看到的相似的结合构象(PDB 6CXS)(补充图S6)。使用Schrödinger分子建模套件，我们将TCS-G对接到Fp2-L1 GUS的活性位点，发现Y479和三个蛋氨酸(M454、455和362)位于可能接触TCS-G的位置(图3g)。Y479或M362突变为丙氨酸显著降低了TCS-G加工，而M454或M455突变为丙氨酸显著增加了TCS-G加工，可能是通过减少TCS-G转换期间的空间闭塞(图3h)。我们通过圆二色性证实，与野生型酶相比，突变蛋白没有表现出显著的结构变化，表明突变是TCS-G活性下降的直接原因(补充图S7a，b)。此外，与另一种Loop 1 GUS酶(大肠杆菌GUS酶)相比，蛋氨酸362和455是Fp2-L1 GUS酶所独有的，我们发现它不能很好地利用TCS-G(图3a，b)。总之，这些结果表明特定的Fp2-L1 GUS残基对于TCS-G加工很重要。最后，各Loop 1 GUS酶的环结构可能在底物处理能力中起关键作用。不幸的是，在迄今为止已确定的几种结构中，该环仍未得到解决，这使得很难阐明该环在底物识别中所起的结构作用。多序列比对显示，Loop 1 GUS酶之间的序列同源性很小(补充图S9)。例如，即使是具有相似催化效率的酶，如E. eligens和Fp2-L1 GUS，它们的Loop 1区域也几乎没有共同点，可以在环结构和酶功能之间建立相关性(补充图S9)。尽管如此，与其他环类相比，在Loop 1位置存在一个环似乎更有利于TCS-G绑定。 除了Loop 1 GUS酶外，我们对纯化酶的体外实验结果表明FMN结合的GUS蛋白，特别是R. hominis 3(Rh3)GUS，也能有效处理TCS-G(图3a，b)。因此，我们确定了Rh3 GUS的晶体结构并将其细化到2.4Å分辨率(补充表S3)。该结构揭示了一种蛋白质二聚体，其活性位点位于结合FMN分子的~30Å处(图3i)。使用与上述类似的对接和诱变方法，我们验证了特定的结构基序，包括残基F406和Y430，以及C端结构域(参见补充图S10中的C端结构域方案)，对TCS-G加工至关重要(图3j)。同样，与野生型蛋白相比，这些突变蛋白没有表现出结构变化(补充图S7c，d)。与另一种FMN结合GUS蛋白R. hominis 2(Rh2)GUS相比，F406是Rh3 GUS所独有的，我们显示了较差的TCS-G处理(图3a,b，参见补充图中Rh3 GUS和Rh2 GUS的比对；图S11)。Rh3 GUS和Rh2 GUS在其C端区域也有所不同，它们的C端序列仅有27%的序列同源性，这可能是它们活性差异的原因。总之，这些结构研究表明，与不能有效利用TCS-G作为底物的其他酶相比，具有高效TCS再激活活性的肠道微生物GUS酶含有这些同源物独有的基序。 6 肠道微生物GUS的靶向抑制可消除TCS在体内的促结肠炎作用 本研究确定了肠道微生物GUS酶的靶向抑制对体内TCS肠道毒性的影响程度。由于专门针对肠道微生物酶的遗传工具很少，我们使用药理学方法并使用GUS抑制剂UNC10201652(GUSi)。首先，我们在体外测试了GUSi对TCS-G加工的影响，发现它通过纯化的Fp2-L1 GUS酶以及其他几种Loop 1 GUS酶抑制了TCS-G向TCS的转化，且呈剂量依赖性，IC50值为0.64–4.9 µM(图4b)。我们惊讶地发现GUSi也抑制了FMN结合GUS酶对TCS-G的加工，尽管其IC50值较低，为3.7-13 μM(图4c)。先前关于GUSi的数据表明，该化合物对Loop 1 GUS酶最有效。因此，这里的数据表明，这种化学型也表现出抑制FMN结合肠道微生物GUS酶的能力。接下来，我们通过体外粪便酶混合物测试了GUSi对TCS-G加工的影响。虽然在这个阶段只剩下两个男性和两个女性粪便样本进行测试，但我们发现GUSi抑制TCS-G加工的方式反映了每个检查样本中存在的GUS水平。特别是，GUSi对含有较高水平Loop 1 GUS酶的离体样品表现出更有效的抑制作用(图4d，e)。这些数据表明，GUSi在体外和体外人类粪便提取物中阻断TCS-G加工，对Loop 1和FMN结合的GUS酶都有影响。在证明GUSi抑制GUS介导的TCS-G加工后，我们进一步对GUSi进行了表征。我们之前的研究表明，GUSi对大肠杆菌的生长或哺乳动物GUS酶的活性没有影响；人类GUS缺失会导致Sly综合征，这是一种可能致命的溶酶体贮积病。此外，我们发现GUSi对治疗小鼠的回肠、近端或远端结肠上皮细胞增殖没有影响。在本研究中，我们进一步研究了其对肠道生理的影响。首先，我们通过口服管饲法用1 mg/kg GUSi处理C57BL/6小鼠，发现用GUSi治疗3-4周对小鼠体重、结肠长度、结肠或系统性炎症或结肠组织学的影响很小(补充图S12)。GUSi处理对小鼠粪便微生物群的多样性或组成也几乎没有影响(补充图S13)。接下来，我们发现用浓度高达10 μM的GUSi处理24 h对小鼠或人肠道细胞的体外生长几乎没有影响(补充图S14)。综上所述，这些结果表明GUSi有效抑制了GUS介导的TCS-G加工，但对共生微生物、哺乳动物肠道细胞或哺乳动物GUS酶几乎没有影响，说明GUSi对肠道微生物GUS酶具有高度选择性，因此利用GUSi研究微生物GUS酶在TCS肠道毒性中的功能作用是可行的。 利用GUSi来确定肠道微生物GUS酶在TCS促结肠炎作用中的作用。我们用对照剂或TCS治疗小鼠，通过灌胃给药或不给药1 mg/kg GUSi，并检查葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导小鼠结肠炎的发生情况(图5a)。我们发现TCS暴露增加了DSS诱导的小鼠结肠炎的严重程度，类似于之前报道的情况。然而，这种效果被GUSi的共同管理所消除。在没有GUSi的情况下，TCS暴露会加剧DSS诱导的结肠炎：与对照相比，TCS治疗缩短了结肠长度(图5b)，导致更严重的隐窝损伤(图5c)，增强了免疫细胞的结肠浸润，包括CD45+白细胞、CD45+F4/80+巨噬细胞和CD45+Gr1+中性粒细胞(图5d)，以及结肠中促炎基因(Tnf-a、Mcp-1、Il-6、Il-17和Il-23)的表达增加(图5e)。然而，通过GUSi的共同给药，TCS的促结肠炎作用在所有测量中都被消除(图5b-e)。因此，肠道微生物GUS酶的抑制可消除TCS的促结肠炎作用，支持了TCS的肠道毒性需要肠道细菌产生的GUS酶的结论。 为了验证GUSi介导的靶标参与，我们首先测试了GUSi是否可以到达肠道。LC-MS/MS研究表明，在最后一次口服GUSi后2天，在处理小鼠的结肠组织中检测到GUSi化合物(补充图S15a，b)。接下来，我们分析了肠道组织中TCS(GUS的产物)和TCS-G(GUS的底物)的浓度。LC-MS/MS检查显示GUSi处理显著降低了处理小鼠结肠食糜中TCS与TCS-G的比率(补充图S15c)。因此，口服GUSi可到达肠道并抑制肠道微生物GUS介导的TCS-G向TCS的转化，支持GUSi在小鼠中的靶向参与，并有助于验证TCS肠道毒性需要肠道微生物GUS酶的结论。 上述结果表明，肠道微生物GUS催化的TCS-G转化为TCS会导致结肠炎，这表明TCS(而非TCS-G)会诱发结肠炎症。为了测试这一点，我们研究了TCS与TCS-G体外诱导结肠炎症的作用。用1 μM的TCS或TCS-G处理肠上皮细胞(MC38)并观察炎症反应。1 μM浓度是基于上述数据选择的，这些数据表明TCS暴露的人类粪便中的TCS高达~1000 pmol/g(~1 μM，参见补充图S2a和补充表S1)。我们发现，使用TCS(而非TCS-G)处理MC38细胞后，促炎细胞因子IL-6的基因表达和浓度增加(补充图S16)。这些数据支持这样的结论，即TCS对培养的肠上皮细胞具有直接的促炎作用，而TCS的葡萄糖醛酸化形式则没有。总体而言，动物和细胞培养研究的结果支持以下结论：肠道微生物GUS酶将TCS-G转化为TCS有助于TCS在哺乳动物肠道中的促炎作用。

图4. GUSi抑制肠道微生物GUS酶将TCS-G转化为TCS。a GUS抑制剂(GUSi；UNC10201652)对肠道微生物GUS酶将TCS-G转化为TCS的影响。b GUSi在体外抑制纯化的Loop 1 GUS酶催化的TCS-G向TCS的转化。c GUSi在体外抑制纯化的FMN结合GUS酶催化的TCS-G向TCS的转化。d GUSi抑制体外人粪便样本提取酶催化的TCS-G向TCS的转化。e人类粪便样本中GUS同源物的丰度水平。数据是平均值±SEM，n=3个生物学重复。GUS，β-葡萄糖醛酸酶；GUSi，β-葡萄糖醛酸酶抑制剂。

图5. 抑制肠道微生物GUS酶可消除TCS的促结肠炎作用。a 用80 ppm TCS或对照剂通过饮食处理C57BL/6小鼠，通过口服灌胃或不联合给予GUSi，然后用DSS刺激以诱导结肠炎。b GUSi防止TCS的结肠缩短效应(每组n=6-8只小鼠)。c GUSi降低了TCS对隐窝的破坏作用。左：结肠的代表性H&E组织学图像(比例尺=75 μm)。右图：组织学评分的量化(每组n=5-6只小鼠)。d GUSi可防止TCS诱导的免疫细胞浸润。e qRT-PCR分析显示GUSi降低了结肠中TCS诱导的促炎基因表达(每组n=6-8只小鼠)。数据为平均值±SEM。。两组比较采用Shapiro-Wilk检验验证数据的正态性；当数据为正态分布时，采用双侧t检验确定统计显著性；否则，显著性由Wilcoxon-Mann-Whitney检验确定。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。TCS三氯生，GUSi，β-葡萄糖醛酸酶抑制剂。

讨论

美国FDA于2013年提出并于2016年最终确定，禁止在包括肥皂在内的与水一起使用的非处方消毒产品中销售TCS。引用的关注点集中在细菌耐药性和激素影响上。然而，这一限制并未延伸到牙膏和其他能够到达人体胃肠道的产品。我们最近的研究表明，暴露于TCS可通过肠道微生物依赖性机制加剧小鼠模型的结肠炎。在此，我们阐明了肠道微生物群参与TCS代谢激活和随后的肠道毒性的分子机制。我们的主要发现是特定的肠道微生物酶，特别是Loop 1和FMN结合进化枝的肠道微生物GUS蛋白，介导TCS从其无活性的葡糖苷酸代谢物的结肠再激活，并在此过程中驱动TCS的肠道毒性。我们通过体外和离体蛋白质组学研究确定了涉及的微生物酶，并使用晶体结构定义了代谢激活TCS所需的分子基序。最后，我们证明了靶向抑制肠道微生物GUS酶可以消除TCS在小鼠中的促结肠炎作用，建立了特定微生物蛋白在TCS毒性中的重要作用。综上所述，这些结果定义了一个以前对于像TCS这样的普遍环境化合物未知的转化轴。 先前关于TCS以及许多其他环境化合物代谢的研究主要集中在哺乳动物宿主组织(例如肝脏)中的代谢过程，而它们在肠道组织中的代谢命运尚未得到很好的表征。在本研究中，我们发现在小鼠暴露于TCS后，大多数宿主组织中的主要化合物是其共轭代谢物，如TCS-G，类似于之前报道的；然而，肠道中的主要化合物是游离TCS。我们用不同剂量的TCS(饮食中1、10和80 ppm TCS)处理小鼠，发现在所有测试剂量下，肠道组织具有相似的TCS代谢特征，并且以游离TCS为主。此外，我们发现在小鼠暴露于TCS后，尤其是在较低剂量(饮食中1和10 ppm)下，小鼠肠道组织中的TCS浓度与暴露于TCS的人体受试者粪便中观察到的TCS浓度相当或在几倍之内(参见图1b中的小鼠数据和补充表S1中的人类数据)。这一结果支持使用动物实验模拟人类暴露于TCS是可行的，尽管我们承认使用小鼠模型研究人类暴露于消费化学品(如TCS)存在许多挑战。此外，我们发现在人类接触TCS后，人类粪便样本也表现出与我们在动物实验中观察到的相同的TCS代谢特征，并且含有大量的游离TCS。综上所述，这些结果支持了与其他器官相比，肠道组织具有独特的TCS代谢特征。通过结合体外培养肠道细菌、抗生素介导的体内肠道细菌抑制以及无菌小鼠等方法，我们发现肠道微生物群在结肠中将TCS-G转化为TCS，从而形成了TCS在结肠中独特的代谢谱。总体而言，这些结果支持了一个模型，即TCS暴露后，它在宿主组织(特别是肝脏)中代谢，并转化为TCS-G等共轭代谢物，然后释放到肠道，在结肠中进行细菌去葡萄糖醛酸化。其他胃肠道因素，如肠道运动和食物摄入，已被证明可以调节药物的药代动力学，这些因素也可能影响TCS在肠道中的代谢命运。除了TCS，由于肠道微生物的代谢活动，其他环境化合物也可能在肠道组织中具有独特的代谢特征，这突出了将微生物群纳入我们对环境毒理学理解的重要性。 迄今为止，与环境污染物毒性有关的特定肠道微生物酶在很大程度上仍是未知的。这部分可以通过肠道微生物酶的多样性来解释：人类微生物组计划的测序数据表明，人类和小鼠肠道微生物群含有数百种独特的肠道微生物GUS酶，它们具有不同的底物特异性，从小化合物到大分子不等。可以从进一步的微生物群测序和/或功能表征中鉴定出新的肠道微生物GUS酶。GUS酶之间底物特异性的这种变化部分是由于包围GUS活性位点的环的长度和位置。使用来自人类微生物组项目数据库的序列数据，我们根据GUS酶的环结构将其分为七个结构类别。我们创建了一组32种纯化的肠道微生物GUS酶，代表七类，用于体外酶测定。使用这种策略，我们观察到Loop 1和FMN结合GUS酶在体外处理TCS-G时特别有效。 这一结果表明，这两个类别也可能是TCS-G体内转换的主要原因。为了支持这一观点，使用基于活性探针的蛋白质组学方法，我们发现fimo中Loop 1 GUS(而非其他类别如Mini loop 1、No loop、No Loop GUS)与TCS-G转换有关。然而，我们感到惊讶的是，FMN结合GUS酶与fimo中的TCS-G转换之间没有相关性。一种可能的解释是，Loop 1 GUS酶主要在连续的Loop 1序列基序中变化，其长度仅有15-20个残基。相比之下，FMN结合的GUS酶主要分布在其长度约为150个残基的C端结构域。迄今为止，还没有关于FMN结合GUS C端结构的报道，因为它们在迄今为止确定的结构中仍然是可移动的和未解析的。序列同源性似乎不足以区分快速和慢速处理FMN结合酶之间的差异。例如，两个最快的FMN结合酶Rh3和R. gnavus 3 GUS之间的序列同源性为52.1%，而最快和最慢的FMN结合酶Rh3和Rh2 GUS之间的序列同源性为50.9%。高效或快速FMN结合GUS酶的丰度可能与fimo TCS-G加工速率相关；但迄今为止，由于FMN结合GUS酶的C端结构域的大小以及我们对这些结构域的结构知识缺乏了解，对TCS-G加工至关重要的特定基序仍未确定。总体而言，这些结果支持特定的微生物GUS酶加工TCS-G。 通过发现参与TCS代谢和毒理学的特定肠道微生物酶，我们的研究有助于更好地评估其毒性潜力并阐明其在不同人群中的个体效应。根据我们的发现，在TCS暴露后，具有不同丰度Loop-1或特定FMN结合GUS酶的人类受试者可能具有不同的TCS结肠代谢，导致个体间对TCS暴露的生物反应的差异。我们之前的研究表明，人类粪便微生物群中Loop-1 GUS同源物的丰度存在显著的个体差异。在来自人类微生物组计划的139名人类受试者中，约40%的粪便微生物群中没有Loop-1 GUS，而在具有Loop-1 GUS同源物的人群中，存在广泛的Loop-1 GUS丰度水平。本研究中还发现来自不同人类受试者的粪便细菌具有不同丰度的Loop-1 GUS，导致将TCS-G转化为TCS的能力不同。虽然需要未来的研究来确定具有特定微生物GUS活性的个体是否更容易受到TCS暴露的不利影响，但此类研究可以绘制TCS的代谢个体并阐明TCS对人类健康的潜在毒性作用。更重要的是，这些研究将有助于建立肠道微生物酶作为环境毒理学的潜在预测标志物。 本研究结果表明，肠道微生物GUS酶在TCS的代谢再激活和肠道毒性中起关键作用。因为专门针对肠道微生物GUS酶的遗传工具很少，我们使用药理学方法并使用GUSi作为化学探针来阐明TCS的分子机制。我们发现GUSi在体外和离体有效抑制GUS介导的TCS-G加工，对共生微生物、哺乳动物肠道细胞的生长或哺乳动物GUS酶的活性几乎没有影响。这些发现支持GUSi对肠道微生物GUS酶具有高度选择性，因此使用GUSi研究肠道微生物GUS酶在TCS肠道毒性中的功能作用是可行的。接下来，我们发现TCS暴露增加了DSS诱导的小鼠结肠炎的严重程度，然而，共同给药GUSi消除了TCS的促结肠炎作用，证实了肠道微生物GUS是TCS的肠道毒性所必需的。除了DSS诱导的结肠炎模型外，我们之前的研究表明，在SPF Il-10-/-小鼠中，TCS暴露加剧了吡罗昔康诱导的结肠炎。常规饲养的Il-10-/-小鼠发生自发性结肠炎，与吡罗昔康诱导的SPF Il-10-/-小鼠结肠炎模型相比，这种自发模型可以更好地模拟人类IBD。重要的是，要确定TCS暴露是否会加剧自发性Il-10-/-模型中的结肠炎，并阐明微生物GUS酶在自发性Il-10-/-模型中对TCS生物学效应的贡献程度。最后，我们发现TCS(GUS的产物)对培养的肠上皮细胞具有直接的促炎作用，而TCS-G(GUS的底物)在生物学上是无活性的。总体而言，这些结果支持GUS介导的去葡萄糖醛酸化反应导致结肠中游离TCS的积累，并有助于其在体内的促炎作用。由于GUS介导的去葡萄糖醛酸化是一种参与外源性代谢的常见代谢反应，并且已被认为是药物和外源性代谢的第四阶段，我们的研究结果也可能适用于其他环境化学品。

结论

综上，本研究将特定的肠道微生物酶与结肠中TCS的代谢再激活联系起来，并表明这些酶驱动了由TCS引起的不良事件。所提供的数据将有助于更好地评估TCS在不同人群中的个体效应。还建议，鉴于TCS和相关化合物可能造成肠道损伤，应重新考虑其安全性。除了TCS，肠道微生物酶还可能对其他化学物质的代谢和毒理学做出贡献，突出了将微生物群纳入我们对环境毒理学和疾病机制的理解的关键重要性。 原文链接： https://www.nature.com/articles/s41467-021-27762-y 获取此篇微文原文pdf请扫描下方二维码联系微科盟多组学老师即可。

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