生物矿化成核过程中的液液相分离

Liquid-Liquid Phase Separation in Nucleation Process of BiomineralizationQin D, He Z, Li P, Zhang S. Liquid-Liquid Phase Separation in Nucleation Process of Biomineralization. Front Chem. 2022 Feb 4;10:834503. doi: 10.3389/fchem.2022.834503. PMID: 35186885; PMCID: PMC8854647.

生物矿化成核过程中的液液相分离

生物矿化是一门典型的跨学科学科，吸引了生物学家、化学家和地质学家研究其潜在机制。越来越多的研究表明，经典的成核理论并不适用于生物矿物的所有成核过程，聚合物诱导液体前体（PILPs）等相分离结构在非经典成核过程中发挥着重要作用。这些结构能够在生物学或病理学上发挥不同的作用，也可以为仿生应用提供启发性线索。然而，由于液态前驱体的复杂性和跨学科性质，引发了很多混乱和争议。不同领域的研究人员可能会有不同的看法，因为术语和当前的理解状态不是常识。因此，

• •生物矿化是自然界中一个惊人的现象。这些生物矿物的内部结构大多美观且高度有序，这意味着复杂的结晶过程，特别是在成核部分。

• •基于 LLPS 的成核理论正在变得流行。PILP 是第一个提出来确定由酸性聚合物诱导的生物矿物前体的类液体性质的理论。

• •一些研究人员发现，LLPS 可能是成核时碳酸钙的固有特性，而聚合物是 LLPS 过程的参与者。

• •提出了 PNCs 理论，以深入解释小尺度前体的性质。然而，关于 PNC 是否通过 LLPS 聚集的问题仍不清楚。

什么是生物矿化

生物矿化是指描述有机和无机分子复杂相互作用参与的各种生物矿物质形成的迷人过程（ Berendsen 和 Olsen，2015 ； Kim 等，2016 ； Grünewald 等，2020 ； Li 等，2020 ； Schoeppler等人，2021 年 ； 吴等人，2021 年 ）。它是一个典型的跨学科学科，吸引了生物学家 (  Muñoz et al., 2019  )、化学家 (  Yuan et al., 2019  ) 和地质学家 (  Sivaguru et al., 2018  ;  Sivaguru et al., 2020  ;  Sivaguru et al., 2021) ) 找出其潜在机制，并为仿生应用提供启发性线索 (  Cho et al., 2018  )。

生物矿物通常具有高度组织性。它们有吸引力的结构主要是由于有机分子对无机环境的诱导。例如，软体动物珍珠层是一种典型的迷人生物矿物。So Yeong Bahn 等 (  Bahn et al., 2017  ) 对其美丽的外观很感兴趣，发现基质蛋白 pif80 可以通过 LLPS 形成 Ca 2+ -pif80 凝聚层，从而稳定并进一步调节 PILP 样无定形的释放细胞内囊泡中的碳酸钙颗粒，这可能揭示珍珠层的主要生物矿化机制。胆结石病，被认为是一种病理性的生物矿化过程，每年使数百万患者遭受痛苦和手术。Luis E. Munoz 等（ 穆尼奥斯等人，2019 年 ； O'Neil 和 Kaplan，2019 年 ）发现中性粒细胞胞外诱捕器可以像“胶水”一样粘住胆道钙和胆固醇晶体，促进胆结石组装。当抑制先天免疫系统时，胆结石的形成和生长也被显着抑制。此外，姜文革等（ Jiang et al., 2017 ) 观察到碳酸钙的手性结构可以通过添加手性酸性氨基酸（Asp 和 Glu）轻松控制。当将L-和D-对映体分别加入过饱和碳酸钙溶液中时，碳酸钙形成的手性环可以分别以逆时针或顺时针方向螺旋。该研究强调了有机分子在生物矿化晶体生长部分的关键作用（ Jiang et al., 2018 ）。

这些高度组织化、吸引人的结构表明生物体控制晶体成核和生长的能力，这还没有被完全理解。在所有自组装过程中，成核是结晶的第一步，并可能严重影响进一步的晶体生长。第一个晶体是如何出现在溶液或胶体中的，尽管已经研究了几十年，但仍不清楚。如果不更好地了解成核过程，似乎很难弄清楚全局结晶或生物矿化过程。

经典成核理论面临挑战

两种成核理论，包括经典成核理论 (CNT) 和非经典成核理论，通常用于解释晶体成核 (  Erdemir et al., 2009  )。CNT是说明成核过程的最简单的理论。吉布斯 (  Gibbs, 1878  ) 在 19 世纪首先提出了这一理论，用来描述过饱和蒸汽凝结成液相的过程。经过其他创始人的多次努力，CNT现在已被广泛应用于解释溶液的成核动力学（ Guo and Severtson, 2003  ;  Qiao et al., 2019  ;  Xu et al., 2021 ）。它包含对均质成核和异质成核两种情况的解释。均相成核说明了过饱和溶液中原子核的形成是单体缔合随机波动的结果。根据 CNT，假设原子核是球形的，并且全局自由能 (  ΔG _  ）的原子核可以表示为 等式。(1) 。

  ΔG = _ 43πr3ΔGν+ 4 πr2γp

(1) 体能  是成核的驱动力，可以降低由温度 (T)、玻尔兹曼常数 )、过饱和度 (S) 和摩尔体积 (v)。  

  ΔGν= -ķb吨l n (小号)v

(2)

体能引起的减小程度与核半径 (r) 的立方成正比。界面能 (  γp  ) 是成核的阻力，可以增加全球自由能。由界面能引起的增加程度与原子核半径的平方成正比（ Gibbs, 1878  ;  Gebauer et al., 2014 ）。函数曲线 ( 图 1A ) 是根据这个假设绘制的。全球自由能的顶点称为自由能垒，能够使全球系统克服自由能垒的原子核半径定义为临界尺寸（ Smeets et al., 2017 ）。正如我们所看到的，为了实现自由能垒，  ΔG _  应满足条件 方程。(3) 。

图1

经典成核理论的示意图。(A)体积能量与核半径的立方成正比。而界面能与原子核半径的平方成正比。全局自由能的最高点称为自由能垒，能够使全局系统克服自由能垒的原子核半径定义为临界尺寸。(B)溶质首先可以克服自由能垒 (  ΔG 1 _  ) 以达到亚稳态。然后，致密液滴中的溶质可以克服自由能垒（  ΔG 2 _  ) 来完成成核过程。

以 方程。1 和 等式。(3) 综合考虑，我们可以推断出临界尺寸可以表示为 等式。(4) 。

  rc r i t= - 2γpΔGν

(4) 那么，原子核应该克服的自由能垒可以表示为 方程。(5) 。

  ΔGc r i t= 16π _γ3p3 ΔG2ν

(5) 众所周知，生物矿化中的大多数固相成核是异质的。异质成核说明了由于外来分子的存在而加速的成核过程，这些外来分子可以充当异质核并降低自由能垒。异质成核的全局自由能可以表示为 方程式。(6) 。

  ΔG = Δ _ G嗬嗬_ _F( m , x ) ( 0 ≤ f     (米, x ) ≤ 1 )

(6)

在这个等式中，代表界面相关因子，代表由于外来分子的出现引起的自由能垒的降低程度。它由界面相互作用参数 (m) 和外来分子的相对大小决定，范围为 0 到 1。当  F(米, x ) → 1  ，它代表外来分子与溶液之间的相关性较差，全局自由能几乎等于均匀成核中的自由能。然而，当  F(米, x ) → 0  ，自由能垒几乎被取消，反映了与均匀成核相比促进的成核过程。

如今，随着实验仪器的快速发展，越来越多的研究人员发现，无论是均相成核还是异相成核，CNT预测的成核过程与实验结果在许多方面都不一致，这可能是由于过于简单化了成核模型。Deniz Erdemir 等（ Erdemir 等人，2009 ) 总结了 CNT 的一些缺点，包括假设原子核具有均匀的内部密度以应对许多复杂情况，忽略表面张力的曲率依赖性，忽略两个以上粒子之间的碰撞以及两个预先存在的粒子集群等等。这些挑战在很大程度上限制了对成核的理解，需要提出新的理论来解释复杂的成核过程。

当非经典成核理论遇到 LLPS

非经典成核理论表明，在从液相形成晶核之前，首先出现一个亚稳前驱相，然后晶核可以在这个亚稳前驱相中出现（ Ma et al., 2017  ;  Schreiber et al., 2017） al., 2017  ;  Liu et al., 2019  ;  Li C et al., 2021  ;  Xu et al., 2021  )。前体相可以以多种形式显示，包括无定形纳米颗粒、液滴、复合物等。

液-液相分离 (LLPS) 是一个流行的跨学科概念，是化学的核心 (  Freedman, 2020  ;  Martin 等人, 2020  ;  Park 等人, 2020  ;  Riback 等人, 2020  ;  Iwata 等人) al., 2021  )、生物 (  Ahn et al., 2021  ;  Li RH et al., 2021  ;  Deepankumar et al., 2021  ;  Huang et al., 2021  ) 和物理 (  Martin et al., 2021  ) 过程自然。来自多个研究领域的数百篇高水平文章聚焦于 LLPS，并试图弄清楚它的形成、表现和监管（ Zhang et al., 2018  ; 阿尔贝蒂等人，2019 ； 凯斯等人，2019 年 ； 吉布森等人，2019 ； Martin 等人，2020 年 ）。简而言之，LLPS是指一种物理化学过程，通过该过程，混合良好的流体可以分离成稠相和稀相。随着实验工具的快速发展，研究人员发现许多溶液前体以 LLPS 的形式存在。这一事实意味着富含溶质的液滴首先会从整个溶液中分离出来，并且可以大大降低成核自由能垒。从热力学的角度来看（ 图 1B ），非经典成核理论假设溶质可以首先克服自由能垒（  ΔG 1 _  )，远低于 CNT 理论中的自由能垒 (  ΔG 0 _  )，以达到亚稳态。这种状态可能是 LLPS 致密液滴的形式，许多研究人员已经观察到了这种情况。然后，致密液滴中的溶质可以克服自由能垒（  ΔG 2 _  ) 来完成成核过程。然而，由于液态前驱体的复杂性和跨学科性质，引发了很多混乱和争议。不同领域的研究人员可能会有不同的看法，因为术语和当前的理解状态不是常识。因此，我们的团队回顾了最近关注各种生物矿物成核过程的文章，以阐明对一些基本概念的最新理解，并指导新人进入这个复杂而迷人的领域。 图 2 ）。

图 2

成核过程的示意图。在所有成核过程中，确定了三个依赖于 LLPS 的成核过程，包括 PILP、无定形颗粒和 PNC。

碳酸钙

碳酸钙是生物矿物中研究最多的成分。对其液态前驱体的研究始于2000年，Laurie B. Gower等（ Gower and Odom，2000 ）首先提出了聚合物诱导液态前驱体的概念，开启了液态前驱体研究时期。他们将聚天冬氨酸等酸性多肽添加到过饱和碳酸钙溶液中，以模拟生物分子的诱导功能，并原位观察表明，随后形成了具有明显边界的大液滴。这种现象随后被命名为 PILP。进一步的研究表明，不同类型的聚合物会导致不同的结晶形态，例如聚αL-天冬氨酸的成瘾通常会导致方解石镶嵌膜的条纹，而聚α，β，D，L-天冬氨酸往往会产生较厚，孤立的片剂。他们解释说，晶体的不同形态可能是由于其液体前体的各种形状造成的。PILP理论强调聚合物的重要性，他们假设聚合物可以螯合和浓缩离子物质，然后形成亚稳态溶液（ 图 3 ）。 Wolf 等人 后来确定了诱导前体的液体性质。(2017)于 2017 年使用 原位原子力显微镜 (AFM)。

图 3

PILP 过程的示意图。PILP理论假设聚合物可以螯合和浓缩离子物质，然后形成亚稳态溶液。

PILP的概念激发了研究人员的热情。 Olszta 等人 进行的进一步研究。(2003)通过矿化 I 型胶原蛋白证明了 PILP 理论的概念验证。进行扫描电子显微镜 (SEM) 分析并说明生物矿化过程如下。随着聚丙烯酸的加入，首先形成了一种液体状的碳酸钙前体。由于 PILP 和溶液之间有清晰的相界，很容易产生毛细力。然后液体状前体可能会渗入胶原蛋白裂缝中，从而产生充满空间的晶体（ 图 4 ）。在海胆的脊椎中也发现了类似的现象（ Cheng 和 Gower，2006 年 ）。

图 4

胶原矿化的示意图。随着聚丙烯酸的加入，首先形成了一种液体状的碳酸钙前体。由于 PILP 和溶液之间有清晰的相界，很容易产生毛细力。然后，液体状前体会渗入胶原蛋白裂缝中，从而形成充满空间的晶体。

然而，研究人员并未完全接受 PILP 理论。一些研究人员（ Bolze 等人，2002 年 ； Pontoni 等人，2003 年 ）开始探索聚合物能够控制成核过程的程度。2004 年，Faatz 等人。（2004）通过光散射实验和扫描电镜观察，首先证明了无定形碳酸钙（ACC）可以通过液-液相分离过程从整个溶液中分离出来，通过氯化钙和二氧化碳的反应（可以均匀地产生碳酸钙）。即使没有聚合物的参与，也可以分析整个反应系统何时达到适当的浓度和温度。 沃尔夫等人。(2008) 通过设计超声波阱并使用同步加速器X射线散射技术进行观察，提供了更有说服力的证据，以实现对成核过程的实时和较少干扰的观察。他们的实验进一步证明了ACC可以随着过饱和度的增加而增加LLPS方式，而无需任何添加。

这些事实表明，当从母相成核时，LLPS 可能是碳酸钙的固有特性，并且聚合物可以作为 LLPS 过程的促进剂或参与者，特别是称为 PILP。Stephan E. Wolf 等人随后反思了 PILP 和 ACP 之间的潜在联系，并以 Gallus gallus 的蛋壳为例重新定义了 PILP 的概念（ Wolf et al., 2011 ）。首先，他们的小角中子散射（SANS）数据表明，卵清蛋白可以积累钙离子，降低本体溶液的钙活性，增加蛋白质旁边的钙浓度，从而缓解过饱和状态，从而稳定蛋白质。ACC 阶段。然后，进行电喷雾电离质谱（ESI-MS）以证明ACC液滴带负电和静电稳定。在这种情况下，当添加带负电荷的酸性蛋白质如卵白蛋白 (pI = 4.7) 时，LLPS 阶段可以稳定下来，并且类似于 Gower 等观察到的 PILP 过程。然而，当添加带正电荷的蛋白质如溶菌酶 (pI = 9.3) 时，整个系统变得不稳定并导致强烈的聚结。他们假设 PILP 涂层效应的内部机制是 ACC 相不稳定的结果。该理论统一了ACC和PILP理论，有力地证明了有机聚合物对无机物的调控。此外， Gautron 等人。(2021) 总结了一些特定蛋白质的作用，例如卵转铁蛋白 (OVOT) (  Panheleux et al., 1999  )、卵清蛋白 (OVA) (  Dunn et al., 2012  )、ovocleidin-17 (  Reyes-Grajeda et al., 2002) ）、骨桥蛋白（OPN）（ Hincke 等人，2012 年 ）和钙结合蛋白（CaBPs）（ Stapane 等人，2019 年 ； Stapane 等人，2020 年 ），它们可以在禽蛋壳生物矿化过程中发挥重要作用。这些研究可能解决鸡蛋壳基质蛋白如何影响和调节ACC矿化的问题，为有机聚合物可以调节无机物生物矿化的假说提供有力的证据。

基于 LLPS 理论的 ACC 和 PILP 概念在探索非经典成核过程方面取得了一些进展。然而，这些理论主要是基于对液态前驱物的观察和浓缩探测。为了深入了解这些前体的性质，必须在较小的范围内提出假设。Gebauer 等人随后提出了预成核簇 (PNC) 理论。 (2008) 2008 年，使用钙离子选择性电极测量游离钙离子。他们发现，无论是在欠饱和阶段还是过饱和阶段，检测到的游离钙离子总是小于并与添加的钙离子或碳酸根离子成正比。考虑到结合的钙离子和碳酸根离子之间的线性关系，他们假设在核前过程中发生了钙的多重结合，这被称为 PNCs。成核后，进一步添加的钙会被颗粒的生长所消耗，然后在热力学上形成恒定的溶解度浓度。进一步应用分析超速离心（AUC）间接证明了他们的理论。结果表明，在成核之前，可以用大约 70 个钙离子和碳酸根离子组合成一个簇来识别小尺寸簇。由于簇聚集，也可以检测到更大的簇物种（流体动力学直径~4-~6 nm）。然而，当涉及到成核后阶段时，无法再检测到较小的星团。这些事实支持了稳定团簇聚集并导致成核的假设，这与 CNT 预测的不稳定团簇有很大不同（ 图 5 ）。

图 5

PNCs 理论的图解草图。PNCs 理论假设稳定的簇聚集并导致成核。一些研究人员认为 PNCs 粒子可以聚集并形成依赖于 LLPS 的结构，然而，其他研究人员使用经典理论来解释 PNCs 的聚集。

如何说明 PNCs 在成核前的行为，以及如何解释 PNCs 聚集的类液体特性困扰了科学家近 10 年。PNC 聚集中是否存在 LLPS 仍不清楚。 格鲍尔等人。(2008) 只提供了 PNCs 存在的间接证据，并没有证明 PNCs 和 LLPS 之间的关系。关于 PNC 是否通过 LLPS 聚合的争论仍在继续。相当多的研究人员支持 PNC 通过 LLPS 聚合的观点。2009 年， Pouget 等人。(2009) 采用低温透射电子显微镜 (cryo-TEM) 来证明碳酸钙溶液中存在低聚簇。亚当· 华莱士等人。(2013) 使用分子动力学模拟并在可以观察到PNC的浓度范围内观察到稠密的液相。2020 年， Avaro 等人。（2020） 证明，当使用电位滴定法和停流 ATR-FTIR 光谱法越过双节线极限时，溶质 PNC 可以形成相分离的纳米液滴。

多项证据（ Habraken 等人，2013 年 ； Liu 等人，2015 年 ； Schreiber 等人，2017 年 ）似乎支持 PNC 的 LLPS 观点。然而，许多研究人员不同意这些观点。例如， Henzler et al., 2018  ) 用经典成核理论预测碳酸钙PNCs的成核过程，发现与实验数据有很大的一致性，这与LLPS的非经典成核方式观点背道而驰。所以，PNCs的属性鉴定还需要进一步的直接证据（ 图 5 ）。

磷酸钙

磷酸钙（CP）是一种重要的生物矿物前体。CP可以结晶成羟基磷灰石（HAP）纳米晶体，成为骨骼和牙齿等生物矿物质的主要成分。然而，结晶过程仍不清楚。 Olszta 等人 进行的研究。(2003)证明了碳酸钙和 I 型胶原蛋白之间的复杂相互作用，为 PILP 理论提供了概念验证证据。然而，骨骼主要由胶原原纤维和HAP组成。碳酸钙与胶原蛋白相互作用的模拟并不能真实反映骨骼的生物矿化过程。因此，该团队进行了更深入的分析（ Jee et al., 2010 ）。首先将酸性多肽（作为骨骼中非胶原蛋白的模拟）添加到矿化 CP 溶液中，然后诱导形成液体状无定形磷酸钙 (ACP) 前体。合成的胶原海绵随后被矿化，其微观结构与骨骼相当。酸性多肽分子量越大，生物矿化程度越高，反应速度越快。因此，他们得出结论，PILP 是骨矿化的关键部分。该团队还成功地在体外对脱矿的海牛骨进行了再矿化，以进一步证明他们的假设（ Thula et al., 2011 ）。

基于他们的研究，许多科学家专注于骨骼的生物矿化，从而加深了对它的理解。2014 年， 罗德里格斯等人。(2014) 意识到使用聚天冬氨酸的聚合物模拟与真实的生物学条件相去甚远。他们做了很多努力寻找骨生物矿化的负责人，发现骨桥蛋白具有成为 PILP 诱导剂的潜在特性，因为骨桥蛋白具有连续天冬氨酸残基的结构域，以及许多磷酸化残基，以及内在无序的结构, 容易诱发 LLPS。他们的实验表明，骨桥蛋白可以以 PILP 依赖的方式指导原纤维内矿化，并可以激活破骨细胞。以这项研究和 ACC 研究 (  Wolf et al., 2011 ) 综合考虑，我们可以认识到酸性聚合物在 PILP 过程中所起的作用更可能是引导剂或促进剂，而不是诱导剂。

2020年， 何等人。(2020)报告了使用 原位透射电子显微镜 (TEM)对 HAP 矿化途径的机理研究。他们发现，HAP 的矿化不仅受经典途径的控制，还受非经典途径的控制。通过经典方式，HAP 直接从溶液中成核，而通过非经典方式，ACP 可以作为 ACP 表面上 HAP 成核的底物。这项研究意义重大，也为我们对CNT与非经典成核理论之间的关系带来了新的思考，它们可能是辩证统一的，而不是完全相反的，并且可以在相似的情况下并存。

一些病理性生物矿物质的形成也与 CP 有关。 阿莫斯等人。(2009) 报道Randall斑块的形成可能与ACP的PILP过程有关。他们将聚-L-天冬氨酸添加到 CP 溶液中，并通过 SEM 观察到通过 PILP 途径形成的多层 CP 小球。这些小球惊人地类似于肾结石，这提供了一些线索，表明 PILP 可能是肾结石形成的必要过程（ Chidambaram 等人，2015 年 ； Lovett 等人，2019 年 ； O'Kell 等人，2019 年 ）。

有机生物矿物

有机物的成核过程对研究人员来说仍然是个谜。许多有机生物矿物尚未研究。在这些有机生物矿物中，草酸钙似乎是自然界中最常见的生物矿物之一。它占某些植物干重的80%以上，是肾结石等病理性生物矿物质的主要成分。一些研究人员（ Qiu et al., 2004  ;  Hajir et al., 2014  ;  Gehl et al., 2015  ;  Kolbach-Mandel et al., 2015 ）发现在草酸钙成核之前就存在无定形相。然而，这种预成核非晶相的性质仍不清楚。 Ruiz-Agudo 等人。(2017) 试图用PNCs理论来说明它的性质。他们的结果表明，草酸钙可以首先在溶液中形成预成核簇。簇通过聚集生长并且可以在这个过程中诱导LLPS，从中形成无定形草酸钙成核。柠檬酸盐可通过胶体稳定作用抑制整个成核过程。这项研究可以帮助我们了解草酸钙的成核过程，并可能导致肾结石的潜在预防策略。

正如我们所知，大量蛋白质可能会根据其固有无序区域 (IDR) 发生 LLPS，并且可能以非经典方式凝聚，这可能导致一系列疾病。例如，微管相关蛋白 tau 的不可逆液体到固体转变与阿尔茨海默病 (AD) 密切相关。 韦格曼等人。（2018） 在体内和体外观察tau液滴的形成，发现tau的细胞内LLPS可导致高浓度的亚细胞灶，这可能是其生理作用的结构基础。异常磷酸化可能导致 tau 成核，从而导致 AD。 张等人。(2020) 观察到活细胞中的蛋白质 tau 相变。他们发现 tau 富含脯氨酸的结构域可以通过其磷酸化来驱动和调节 LLPS，这可能是 AD 的潜在机制。与蛋白质 tau 类似，蛋白质 FUS (  Murakami et al., 2015  ;  Monahan et al., 2017  ) 和一些 RNA 结合蛋白 (  Kato et al., 2012  ;  Kroschwald et al., 2015  ) 也被证明经历了 LLPS 过程并以非经典方式聚合。

此外，许多研究人员开始研究 RNA 在 LLPS 中的作用。由于 RNA 的结构对盐浓度、pH 和离子组成等许多因素都很敏感，因此对于 RNA 如何促成这一凝聚过程的了解有限（ Roden 和 Gladfelter，2021 年 ）。 张等人。(2019) 发现 G-四链体 (GQ) 形式的 RNA 可以在生理条件下触发 LLPS，这为 RNA 在触发或维持 LLPS 中的作用提供了第一个证据。这可能是揭开 RNA 成核之谜的开始。

LLPS状态大多是不稳定的，在自然界中被认为难以实现或维持，但研究表明，LLPS似乎可以被细胞很好地利用和调节，这是惊人的，值得进一步研究。

有机生物矿物的成核过程还存在许多问题，如胆结石、动脉粥样硬化斑块等。这些结构主要由胆固醇晶体组成，人们对此知之甚少。我们的团队正专注于胆结石的形成机制，希望弄清楚胆固醇的成核途径。

仿生应用

生物矿物通常具有高度组织性。它们的特殊结构不仅可以提供漂亮的外观，还可以提供出色的机械性能，就像大自然的精神一样。在某种程度上，这些生物矿物比人造材料具有更好的性能。因此，研究人员研究了仿生应用来模拟生物矿物（ Wang 等人，2015 年 ； Picker 等人，2017 年 ； Huang 等人，2019 年 ； Yang 等人，2021 年 ）。Laurie B. Gower 等（ Kim 等人，2007 ) 2006年首次提出PILP可用于仿生应用的想法。PILP理论表明聚合物可以诱导类液体矿物前体，液体前体可以优先沉积在制备的功能化模板上。将这一特性与微接触印刷技术联系起来，他们的研究为进一步仿生利用提供了理论基础。

在此可行性测试的基础上，发明了许多仿生应用（ Antebi et al., 2013 ）。 李等人。(2012) 使用 PILP 工艺将制备的致密胶原膜矿化，并生产出更坚固、生物相容性更高的骨移植生物材料，可与骨骼相媲美。他们的进一步研究 (  Li et al., 2015  ) 将矿化模板更新为由类弹性蛋白重组体组成的热响应水凝胶，以实现受控形态发生。然后 PILP 前体结晶形成紧密堆积的晶体，由于弹性蛋白样太阳穴的聚集孔隙率，其与牛皮质骨相当。其他研究人员 (  Wingender et al., 2016 ) 对矿化模板也做出了原创性贡献，取得了良好的效果。此外， Thula 等人。(2010) 比较了不同聚合物的诱导能力，包括聚-L-天冬氨酸 (PASP)、聚-L-谷氨酸 (PGLU)、聚乙烯基膦酸 (PVPA) 和聚丙烯酸 (PAA)。然后他们发现 PASP 和 PGLU/PASP 可以产生具有最高矿物质含量的纳米结构复合材料，可用于骨移植。

除了可能用于骨移植外，PILP 工艺还可用于引导骨再生 (GBR) 和骨质疏松症领域。 王等人。(2019) 利用同源 PILP 工艺并生产生物矿化膜。这种膜具有生物相容性，具有高应力强度，还可以促进骨细胞的增殖。我们期待他们的体内实验，并希望能为 GBR 带来新的治疗策略。 姚等人。(2019) 在骨质疏松症领域也取得了令人振奋的进展。他们设计了一种磷酸钙聚合物诱导的液体前体 (CaP-PILP) 材料，并将钙黄绿素染色的 CaP-PILP 液滴注射到骨质疏松小鼠体内。他们惊讶地发现，修复后的小鼠骨骼表现出大大改善的机械性能，甚至可以与正常小鼠相媲美，这为硬组织修复提供了新的思路。基于这项研究（ Yao et al., 2019 ）， Zhou et al. (2021) 探讨了 CaP-PILP 注射对小鼠骨密度和早期种植体骨整合的影响。体内实验表明，CaP-PILP注射组具有优异的骨修复和良好的种植体骨整合。这种 CaP-PILP 材料可能用作辅助疗法，以降低骨质疏松症患者的骨植入失败率。

PILP 在骨骼中的仿生应用不仅限于骨移植。由于 PILP 工艺可以在体外强烈地产生胶原蛋白的纤维内矿化，这与在人体中形成的非常相似，因此 PILP 产生的矿物质可以用作细胞培养基质，用于分析生物行为。例如， Choi 等人。（2019） 使用这种基于 PILP 的仿生系统，发现胶原原纤维的矿化可以通过抵抗肿瘤细胞粘附来减少乳腺癌的骨转移，这为骨转移提供了潜在的预防措施。

牙科中的仿生应用也很受欢迎且实用（ Nurrohman 等人，2016 年 ； Nurrohman 等人，2017 年 ； Saeki 等人，2017 年 ； Saxena 等人，2018 年 ； Bacino 等人，2019 年 ）。类似于骨骼的仿生应用， Bacino 等人。(2019) 利用 PILP 理论，发现添加聚天冬氨酸和树脂改性玻璃离聚物 (RMGI) 可以很容易地诱导 PILP 过程，并且可能是修复龋齿的可行方法。 陈等人。(2020) 试图评估 CaP-PILP 材料 (  Yao et al., 2019  ) 在龋齿牙本质损伤中的可修复性。体外实验表明，CaP-PILP 材料可以成功地诱导脱矿牙本质胶原蛋白的再矿化。较高的 CaP-PILP 可导致增强的再矿化能力。

预防病理性生物矿化是这些应用的重要组成部分。许多患者患有肾结石和胆结石等病理性生物矿化，很少有有效的预防方法可以应用。 迪亚兹-索勒等人。（2021 年） 发现，作为肾结石主要成分的草酸钙前体可以通过形成 LLPS 依赖性 PILP 过程而被聚丙烯酸 (PAA) 稳定。他们发现 PAA 可以稳定多离子复合物，从而延缓成核过程。这些事实可能有助于了解肾结石的病理性生物矿化过程，并为预防肾结石提供线索。

结束语

生物矿化是自然界中一个惊人的现象。这些生物矿物的内部结构大多美观且高度有序，这意味着复杂的结晶过程，特别是在成核部分。在所有成核假说中，基于 LLPS 的理论越来越流行，关于 LLPS 与非经典成核理论之间关系的研究也越来越多。因此，我们按照分子类型和时间线的顺序对它们进行了总结。

PILP 理论是第一个提出来确定由酸性聚合物诱导的前体的类液体性质的理论。Laurie B. Gower 的团队发现了这一现象，并在理论和实验层面领导了相关研究近 20 年。许多生物矿物被确定以依赖 LLPS 的方式经历 PILP 过程，并且由于该理论还发明了许多仿生应用。为了阐明聚合物对成核过程的影响程度，一些研究人员发现，当从母相成核时，LLPS 可能是碳酸钙的固有特性，并且聚合物可以作为 LLPS 过程的促进剂或参与者，这可能特别称为 PILP。这一观点为成核过程提供了新的视角。接下来提出了 PNCs 理论，以深入解释小尺度前体的性质。然而，PNCs 是否通过 LLPS 聚集的问题仍不清楚，仍需要进一步的直接证据。

悬而未决的问题

有机分子和无机分子的相互作用是复杂的，生物通过什么调控网络可以构建出错综复杂的生物矿物？

哪些基因控制着与成核相关的有机分子？在这个过程中是否有任何转录或转录后的规定？我们如何才能在纳米尺度上直接观察 LLPS？PNC 是否通过 LLPS 聚合？

有机结晶在人类中也很常见。肾结石由草酸钙晶体组成，胆结石主要由胆固醇晶体组成。这些病理性生物矿物质难以治疗且容易复发。然而，对于它们的成核和生长过程，尤其是胆结石，目前还没有清楚的认识。

通过了解胆结石的成核过程，是否有可能停止成核并防止疾病复发？

CaP-PILP在骨骼和牙齿中的应用是成功的，是否有可能最终将CaP-PILP应用于治疗患者？