科研 | Gut: 宿主-肠道菌群共代谢产物马尿酸作为代谢健康标志物和介质的人体和临床前研究

导读   

目的：肥胖是一种流行病，会增加患2型糖尿病和心血管疾病的风险。肠道微生物产物可调节宿主代谢。马尿酸盐是最丰富的微生物-宿主共代谢物之一，在肝脏和肾脏中由甘氨酸和微生物苯甲酸盐结合产生。   

方法： 本实验通过人体和动物实验探究了马尿酸盐作为代谢健康的标志物和介质的潜在作用。在271名中年非糖尿病丹麦人中，根据习惯性饮食的摄入量进行分层，对尿样本进行1H-NMR光谱分析，并基于鸟枪测序的肠道菌群宏基因组学来探究马尿酸盐水平与肠道微生物组、膳食脂肪和代谢健康指标的关系。   

结果： 结果表明，尿马尿酸盐与微生物苯甲酸盐生物合成途径的微生物基因丰富度和功能模块呈正相关。通过饮食分层发现，食用富含饱和脂肪的饮食参与者的尿马尿酸盐浓度与基因丰富度无关，但与代谢健康有关。高脂肪喂养的小鼠实验结果表明，长期注射马尿酸盐（20 nmol/天）可改善葡萄糖耐量并增加胰岛素分泌。   

结论： 人体和动物研究均表明，高尿马尿酸盐浓度是代谢健康的标志。在高脂肪饮食引起的肥胖宿主中，马尿酸盐有助于改善代谢。  

论文ID

原名：Human and preclinical studies of the host-gut microbiome co-metabolite hippurate as a marker and mediator of metabolic health

译名：宿主-肠道菌群共代谢产物马尿酸作为代谢健康标志物和介质的人体和临床前研究

期刊：Gut

IF：31.793

发表时间：2021.11

通讯作者：Marc-Emmanuel Dumas

通讯作者单位：英国伦敦帝国理工学院

DOI号：10.1136/gutjnl-2020-323314

实验设计

前言

肥胖是一种流行病，会增加患2型糖尿病和心血管疾病的风险。肠道微生物群失调被认为是这些疾病的关键特征。肠道微生物群是一个复杂的生态系统，包含数以千计的微生物物种和菌株。它是一个动态系统，是核心参与者和稀有参与者之间的连续体。肠道微生物群具有整体的生态系统结构，常用梯度或肠型进行描述。微生物组总共编码1000万个不同的微生物基因。饮食、年龄、生活方式、膳食补充剂（例如甜味剂和药物）等多种因素都会影响肠道微生物群。虽然微生物群可通过产生或降解化合物直接影响宿主的各种生物过程，但参与这种化学串扰的绝大多数分子仍然难以捉摸。 

马尿酸盐是最丰富的微生物-宿主共代谢物之一，在肝脏和肾脏中由甘氨酸和微生物苯甲酸盐结合产生。马尿酸盐与微生物多样性呈正相关，但与血压、非酒精性脂肪肝、内脏脂肪量和克罗恩病呈负相关。这表明马尿酸盐在代谢健康中具有潜在的作用。尽管近期研究部分揭示了马尿酸盐与代谢疾病的关系，但仍需深入探究与马尿酸盐途径相关的营养-微生物组-宿主的相互作用。特别是需要进一步研究

(1)与微生物基因丰富度、生物合成基因模块及肠型的关联；

(2)人群分层，确定马尿酸盐改善代谢健康的患者亚组；

(3)马尿酸盐对宿主表型影响的生物学特征。 

为了解决这些问题，本研究对参与人类肠道宏基因组学(MetaHIT)研究的271名中年非糖尿病参与者的尿液代谢组和粪便宏基因组进行表征，并对其习惯性饮食摄入情况进行记录。研究评估了饮食、微生物组和代谢组之间的相互作用，特别对马尿酸盐通路进行分析，结果表明马尿酸盐会对生物临床表型产生有益影响。肥胖和糖尿病动物模型体内研究进一步证实了该结论。

结果

1 马尿酸盐是与粪便微生物基因丰富度相关性最强的尿液代谢物

为了鉴定出对代谢健康具有有益作用的微生物和宿主化合物，我们使用1H-NMR对MetaHIT群体的尿液代谢组进行分析，以开展微生物基因丰富度的代谢组关联研究(MWAS)。首先建立了一个基于1 H-NMR光谱的O-PLS-DA模型，临界值是之前公布的480000个微生物基因（图1A，p=3.21×10-15）。基因计数密度图反映分层的有效性。交叉验证模型通过排列测试显著预测了与基因丰富度相关的方差（图1B，p=0.1×10-4，10000次随机化）。区分模型系数显示马尿酸盐与微生物基因计数正相关，而肌酐与基因计数负相关（图1C）。微生物基因丰富度低的个体的尿马尿酸盐水平显著低于微生物基因丰富度高的个体的尿马尿酸盐水平（图1D；基于Spearman相关系数rho2=0.173，p=1.99×10-9）。这些数据表明马尿酸盐水平、基因丰富度和Shannon多样性指数之间存在关联（图1E，rho2=0.108，p=2.82×10-8）。

图1 

马尿酸盐是与肠道微生物组的基因丰富度和功能冗余相关的主要代谢物。使用尿 1 H-NMR光谱拟合正交偏最小二乘判别分析(O-PLS-DA)模型获得的分数图（预测分量1）预测微生物基因丰富度，显示高基因丰富度（超过480000个基因计数）与 1 H-NMR谱之间存在显著关联（ p =3.21×10 -15 ，使用F检验的显著非零斜率，N=271）。(B)通过生成具有10000个随机排列的零分布( p =1.00×10 -4 )对O-PLS拟合优度参数Q 2 Yhat 的重要性进行实证评估。(C)曼哈顿图显示 1 H-NMR变量与伪光谱布局的基因计数之间的关联。负值（蓝色圆圈）表示负相关，正值（红色圆圈）表示正相关。灰色圆圈是 p 值>0.01的簇。圆圈的大小表示聚类与基因计数的协方差。(D)尿马尿酸盐强度（马尿酸盐 1 H-NMR峰曲线下面积；AU）与高基因计数（超过480000； p =6.84×10 -8 ）之间的关联。(E)基于线性回归的散点图显示尿马尿酸盐（AU：为可视化目的进行对数转换）和Shannon微生物多样性指数（Spearman's rho 2 =0.108， p =2.82×10 -8 ；N=271）之间的相关性。   

重要的是，尿马尿酸盐水平与体重指数(BMI)、体重、胰岛素抵抗的稳态模型评估(HOMA-IR)、白细胞介素-6(IL-6)、胰岛素和C肽等代谢障碍标志物呈显著负相关（部分Spearman相关性，q<0.1）。尿马尿酸盐水平与血清甘氨酸（合成马尿酸盐所必需的成分）无关（n=269，线性Pearson相关性，r=0.06，p=0.30），与eGFR也无关（r=-0.10，p=0.11)，这可能会限制马尿酸清除率，或者限制这两个变量的联合作用（r=−0.02×10-2，p=0.84）。接下来使用K均值聚类将尿马尿酸盐的数据分层为“高”和“低”。“高”马尿酸盐的个体表现出更高的马尿酸盐水平（p<2.16×10-16）和基因计数（p=2.00×10-5）。此外，马尿酸盐排泄水平较高的肥胖受试者(BMI>25)的胰岛素抵抗(HOMA-IR)显著较低（p=0.0019），然而，纤瘦受试者中这一结果并不显著。接下来，我们使用Bruker IVDr算法推导出绝对马尿酸盐。绝对马尿酸盐值与马尿酸盐(AU)高度相关(rho2=0.76, p<2.2×10-16)，具有高基因计数的个体分泌更多的绝对马尿酸盐(p=0.00015)，且绝对马尿酸盐与基因计数显著相关(rho2=0.11，p=7.17×10-8）。研究发现，分泌马尿酸盐的临界值为3.94mM。为了进一步验证结论，我们使用相应的肌酐值对1 H-NMR峰进行标准化。同样，从建立在肌酐校正的1 H-NMR峰上的O-PLS-DA模型获得的分数与基因丰富度(p=8.12×10-14)、预测基因计数(p=1×10-4；10000排列）和肌酐调整的马尿酸盐具有最强的协方差和高基因计数。基因计数高的个体分泌更多的肌酐调节马尿酸（p=5.38×10-9），肌酐调节马尿酸与基因丰富度（rho2=0.18，p=5.48×10-13）和Shannon多样性(rho2=0.12，p=6.01×10-9）相关。   

2 苯丙烷途径中马尿酸产生的肠道微生物组决定因素 

为了表征苯甲酸盐（马尿酸盐的前体）产生的微生物组决定因素，我们对粪便宏基因组数据进行分析。将集成基因目录(Integrated Gene Catalogue, IGC)的功能注释到KEGG Orthology(KO)组，发现2733个KEGG模块与尿马尿酸盐正相关（pFDR<0.05）。然后，我们手动策划了20个代谢模块，涵盖微生物苯丙烷代谢（含苯甲酸的生成）。每个模块代表一个酶促反应，定义为一组直向同源物组，并由输入和输出代谢物界定。只有两个模块的比例丰度与尿马尿酸水平相关（患病率（存在途径的受试者人数/受试者总数）>20%）。这两个模块分别是可产生苯丙酸盐的肉桂酸转化模块（MC0004；N=271，患病率=100%，Spearman's rho=0.19，q值=0.006）和参与将肉桂酸盐降解为苯甲酸盐过程的香豆酸降解模块（MC0005；N=271，患病率=74%，Spearman's rho=0.21，q值=0.006；图2A）。有趣的是，尽管MC0004代谢不会导致苯甲酸盐产量增加，且MC0004和MC0005会竞争肉桂酸盐，但它们都与尿马尿酸盐呈正相关。这两个模块还与微生物基因丰富度相关（MC0004：N=271，rho=0.63，q值=8.35×10-31；MC0005：N=271，rho=0.34，q值=4.48×10-8)。编码MC0004直向同源物的宏基因组物种主要存在于厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteria）和变形菌门（Proteobacteria）的基因组中。编码MC0005的仅限于（未分类的）厚壁菌门（(unclassified Firmicutes）和变形菌门（Proteobacteria）（图2B），这两个模块在拟杆菌门（Bacteroidetes）中未被检测到。 

图2

 健康志愿者粪便宏基因组中微生物苯丙烷代谢相关模块的检测及其与尿马尿酸盐浓度的关联。在超过20%的个体中检测到编码苯丙烷代谢相关通路的肠道特异性代谢模块(GMM)的可视化；MC0004（橙色；N=271，Spearman's rho=0.19，q值=0.006）和MC0005（蓝色；N=271，Spearman's rho=0.21，q值=0.006）相对丰度与尿马尿酸盐浓度呈正相关。(B)宏基因组物种编码模块MC0004和MC0005。(C)（顶部面板）在属水平上，主坐标分析的第一个平面上可视化的粪便微生物组差异（PCoA，Bray-Curtis差异），单个样本根据肠型拟杆菌门1(Bacteroides 1, Bact 1)，蓝色；拟杆菌门2(Bacteroides 2, Bact 2)，红色；普雷沃氏菌(Prevotella, Prev)，绿色；瘤胃球菌科(Ruminococcaceae, Rum)，黄色。（中间和底部面板）相同一属级PCoA，覆盖一个网格，根据网格每个单元（N=271）内样本中GMMs MC0004（红色）和MC0005（蓝色）的中值丰度进行着色。MC0005相对丰度通过平方根实现可视化。(D)（左图）尿马尿酸盐浓度分布(N=271, Kruskal-Wallis, χ2=41.78, q值=4.45×10-9）；（中图）MC0004肠型的相对丰度（N=271，Kruskal-Wallis，χ2=40.04，q值=1.05×10-8）；（右图）MC0005肠型的相对丰度（N=271，Kruskal-Wallis，χ2=22.25，q值=5.79×10-5）。指出了针对多重测试校正的事后Dunn检验的显著性水平（q值<0.05(*)；<0.01(**)；<0.0001(***)）。箱线图的主体代表分布的第一个和第三个四分位数，带有中线，须从四分位数延伸到1.5×IQR内的最后一个数据点，超出为异常值。   

3 尿马尿酸盐水平与富含饱和脂肪饮食个体的代谢健康改善有关 

接下来，我们使用经过验证的FFQ评估193名参与者的营养摄入量。133个膳食摄入量描述符的主成分分析总结了膳食模式和负荷，突出了四种典型膳食：较高的水果和蔬菜消费量与较高的含有饱和脂肪的肉类（第一主成分（PC1）以及富含碳水化合物的食品与较高的含有不饱和脂肪的鱼类（第二主成分（PC2），这一趋势在食品成分和营养水平上得到了证实。因此，我们使用K-均值聚类法，以饮食PC1为依据对人群进行分层，对比健康饮食（低PC1，高水果和蔬菜消费量；n=126）和高危饮食（高PC1，高饱和脂肪和肉类消费量；n=67）。与肉类、土豆和饱和脂肪等主要食物的消费不同，这两个饮食群中个体的临床变量没有显著差异。 

图3 

仅在食用富含饱和脂肪和肉类饮食的参与者中，尿马尿酸含量升高与葡萄糖稳态改善有关。(A)膳食摄入量主成分分析(PCA)的双标图显示前两个主成分（PCs）的相反膳食。每个PCs的主要驱动程序都用蓝色箭头命名并表示。(B)解释变量对马尿酸盐排泄的个体差异的累积贡献，通过逐步秩变换线性回归进行估计（sLR；n=193）。解释变量包括年龄、性别、体重指数(BMI)、综合基因目录(IGC)丰富度、微生物群苯丙烷代谢模块和主要饮食成分。（C-E）基于线性回归的散点图显示在食用富含脂质饮食人群（高PC1，n=67；红线）和食用富含蔬菜和水果饮食人群（低PC1，n=126，蓝线）中，尿马尿酸盐（AU；通过对数转换进行可视化）与胰岛素抵抗（HOMA-IR）、血浆胰岛素和肿瘤坏死因子-α（TNFα）的稳态模型之间存在关联。(F)热图显示了马尿酸盐或微生物基因计数与肥胖生物临床变量的Spearman相关性，该变量未对马尿酸盐或基因计数进行调整。如图所示，WBTOT_PFAT，全身脂肪百分比。在使用Benjamini-Hochberg方法进行多次测试调整后，**为Spearman p<0.01，*为Spearman p<0.1。(G)示意图说明在调整马尿酸盐或基因计数后，微生物基因计数(GC)或马尿酸盐(Hip)与HOMA-IR之间的Spearman相关性。三角形顶部显示马尿酸盐和基因计数之间未经调整的Spearman相关性。   

为了总结影响马尿酸排泄量差异的主要因素，我们使用逐步秩变换线性回归计算了几个协变量的累积贡献（sLR，n=193；图3B）。微生物基因丰富度占尿马尿酸盐变异的12.95%（p=2.76×10-7），饮食PC1（p=3.78×10-3），MC0020编码马尿酸盐脱水解酶（p=8.36×10-3）和Bact 2患病率(p=3.07×10-2)，分别增加了3.76%、3.02%和1.97%的累积非冗余解释力。虽然基因丰富度与马尿酸分泌呈正相关，但所有其他因素均呈负相关。当用单个食物代替膳食PCs时，单个食物对马尿酸盐的排泄没有显著影响。接下来，我们开始分析饮食习惯、马尿酸盐和血糖控制之间的相互作用。事实上，与低脂肪摄入者（低PC1；rho=−0.151，p=0.096；图3C，蓝色）或整个人群（rho=−0.182，p=0.012；图3C，黑色）相比，马尿酸盐与高危饮食人群的HOMA-IR较低密切相关。循环胰岛素和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）也有类似的结果（图3D、E）。使用K-均值对每个饮食群的马尿酸盐进行分层，结果显示，在67名食用高危饮食的个体中，尿马尿酸盐升高与胰岛素敏感性改善、空腹胰岛素降低和空腹相关脂肪细胞因子（FIAF）降低或C-反应蛋白降低相关。在主要食用水果和蔬菜饮食（低PC1）的受试者亚组中，尽管马尿酸水平与高PC1的受试者相似，但尿马尿酸与任何健康状况改善均无关。 为了弄清马尿酸盐和微生物基因丰富度对高脂肪饮食受试者生物临床变量的影响，我们调整了Spearman的等级相关性。在这个亚群中，与基因丰富度类似，马尿酸盐水平也与低度肥胖和更强的血糖控制能力显著相关（图3F）。然而，在调整分泌型马尿酸盐后，基因丰富度与生物临床变量之间的相关性消失（rho=-0.067，NS），表明基因丰富度和马尿酸盐之间也有关联（图3G）。这一发现表明，马尿酸盐不仅是基因丰富度最强的排泄标志物，而且对由富含饱和脂肪的饮食引起的代谢疾病可能具有有益的作用。   

4 长期马尿酸盐治疗调节小鼠的葡萄糖稳态 

由于马尿酸盐主要与食用富含饱和脂肪饮食受试者的代谢健康标志有关，因此我们研究了马尿酸盐对不同饮食喂养小鼠代谢的影响。用5.55 mM马尿酸盐（0.14 mg/kg/天）处理小鼠。采用皮下输注保证马尿酸盐的持续输送，避免首过代谢，且马尿酸盐不会对体重、BMI或空腹血糖产生影响。结果表明，马尿酸盐降低了CHD喂养的瘦小鼠的葡萄糖耐量（图4A-C）。与对照组相比，马尿酸盐处理的小鼠的葡萄糖激发后30分钟的血糖和ΔG参数显著升高。相反，马尿酸盐改善了HFD喂养的肥胖小鼠的葡萄糖耐量，如显著降低了累积血糖（-23.90%，p<0.005）和ΔG参数（-37.22%，p<0.005；图4E-G）。马尿酸盐处理的瘦小鼠的胰岛素释放和葡萄糖诱导的胰岛素分泌显著增强（图4D）表明马尿酸盐对胰岛素分泌有直接影响。相比之下，在喂食HFD的小鼠中施用马尿酸盐会增强胰岛素分泌，这可能是肥胖小鼠马尿酸盐介导的葡萄糖耐量改善的原因。马尿酸盐显著增加了瘦小鼠（+294%，p=0.0063）和肥胖小鼠（+348%，p=0.0468）的胰岛素阳性区域。Ki67阳性细胞核染色显示，马尿酸盐仅增加了CHD喂养小鼠的β细胞（+289.73%，p=0.0152）。总而言之，马尿酸盐治疗小鼠的数据与人类研究中观察到的代谢改善基本一致：马尿酸盐可改善HFD条件下的葡萄糖稳态并增加胰岛素阳性β细胞质量。  

图4 

长期皮下注射马尿酸盐对C57BL/6J小鼠葡萄糖耐量和胰岛素分泌的影响。小鼠喂食对照食物（A-D）或高脂肪食物（E-H）。测试长期皮下注射马尿酸盐(5.55 mM)42天对葡萄糖耐量(A-C,E-G)和葡萄糖刺激的胰岛素分泌(D, H)的影响，对照小鼠注射盐水。曲线下面积(AUC)为腹腔葡萄糖耐量试验期间血浆葡萄糖值的总和。ΔG是在腹腔葡萄糖耐量试验期间120分钟内综合基线值的AUC。IPGTT期间的所有血糖和胰岛素指标均由每组6只小鼠数据得出。使用未配对的Mann-Whitney检验分析数据。结果为平均值±SEM。*为p<0.05，**为p<0.01，****为p<0.0001。

讨论

本研究将来自MetaHIT研究的271名中年非糖尿病受试者的代谢组学与宏基因组学相结合，发现尿马尿酸盐是与微生物基因丰富度最显著相关的代谢物。马尿酸盐产生的微生物组决定因素分析发现两种与尿浓度相关的代谢模块，其中之一导致其前体苯甲酸酯的合成。然后，分析了苯甲酸和马尿酸盐的微生物群-宿主共代谢之间的饮食依赖性关系，证明马尿酸盐主要与HDF饮食个体的代谢益处相关。我们的研究结果表明，在饮食富含饱和脂肪的人群中，马尿酸盐水平升高是代谢健康的标志。我们的分析为苯甲酸盐生产的微生物背景提供了新的见解，其中两个模块与尿液马尿酸盐的变化显著相关。这些模块包括肉桂酸的降解，肉桂酸是多种植物次生代谢物代谢的中间产物，以大量未经修饰的形式存在于浆果中。苯丙酸途径将广泛的膳食底物（如苯丙氨酸、奎宁酸、莽草酸或绿原酸）连接到苯甲酸，苯甲酸通常是一个共同的终点。这一途径中的饮食和微生物中间产物与有益的健康结果相关。值得注意的是，在本分析中包含的各个模块中，只有编码马尿酸盐水解酶的MC00020对尿马尿酸盐浓度的影响超出了饮食主要成分和肠型。这表明，在非Bact 2肠型中，苯甲酸盐的产生在很大程度上取决于食物摄入量，这与Pallister等人的观点一致。 马尿酸水解酶对尿液浓度的负作用进一步表明，正如三甲胺-N-氧化物所证明，在肠道排泄后，饮食中马尿酸的解偶联率和/或解毒苯甲酸的逆转率增加。这种尿马尿酸盐水平的微生物组决定论似乎对抗了我们在大鼠F2杂交中确定的苯甲酸盐的宿主遗传决定论。 

本研究发现马尿酸盐在高脂饮食环境中发挥有益的代谢作用，这一发现与HFD诱导的肥胖小鼠模型中结论一致。马尿酸盐显著改善肥胖HFD喂养小鼠的葡萄糖耐量。尽管在CHD喂养的小鼠中，葡萄糖耐量表现出饮食与马尿酸反应之间的相互作用，其机制尚不清楚，但主要影响是增加小鼠和人类HFD的葡萄糖耐量。总之，我们的临床前研究表明，马尿酸盐的一些有益代谢作用可能是直接作用于胰腺。这与我们的研究一致，我们的研究显示马尿酸盐与胰岛素抵抗、高血压、肥胖或肝脂肪变性之间存在负相关，且马尿酸盐对β细胞具有保护作用。

结论

综上所述，本研究将马尿酸盐确定为一种关键的微生物-宿主共代谢物，且在西式饮食的背景下，可改善代谢。研究发现，马尿酸盐与胰岛素抵抗、脂肪变性、高血压和肥胖以及微生物生态多样性呈负相关。本研究结果基于几种微生物-宿主代谢状态，不同的代谢状态对宿主的饮食和健康结果有不同的反应，研究探讨了微生物组在人类代谢中的作用，并为个性化营养和分层医学提供了研究思路。

编译：微科盟繁星，编辑：微科盟茗溪、江舜尧。

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