【关注】核酸药物“老兵”适配体，能否焕发新生命？

来源：医药魔方Pro 

适配体药物是核酸疗法的重要组成部分，能够与靶标高度特异性结合，发挥抑制、激活、靶向递送功能，具有许多独特优势。首款适配体药物（培加他尼）于2004年获FDA批注上市（目前由于疗效与销量原因已退市），但之后该领域进展缓慢。本文结合Nature Reviews Drug Discovery的一篇综述，系统介绍适配体药物的应用场景、研发难点，同时结合医药魔方NextPharma数据库盘点目前临床在研代表性项目。 

来源：Nature Reviews Drug Discovery 适配体是短的单链DNA（ssDNA）或RNA分子，通过自折叠形成二级和三级结构，可区分构象异构体、氨基酸突变等结构非常相似的分子，具有高度特异性。 

适配体折叠识别靶标（来源：Molecular Therapy Nucleic Acids） 适配体在许多方面具有独特的优越性。与体积更大的抗体（150-180 kDa，直径约15 nm）相比，适配体体积更小（6-30 kDa，直径约2 nm）、结构更为灵活，可以与较小的靶标或抗体无法接近的隐蔽的位点结合。同时，由于较大的分子量，抗体的组织浸润能力有限，尤其在实体瘤环境中，这可能会干扰抗体药物的疗效。尽管适配体较小的体积将提高肾脏滤过率，缩短体循环时间，但这一特性可通过合理的化学修饰与缀合技术改善。抗体的体内筛选过程冗长、费时且昂贵，而适配体的指数富集的配体系统进化技术（SELEX技术）可在几天内筛选出具有高度特异性的适配体分子。适配体理论上的靶标范围非常广泛，包括抗体无法识别的非免疫原性分子。此外，适配体通过化学合成制造，生产工艺更容易满足cGMP要求，而抗体生产过程中涉及到动物与细胞实验，细菌污染和批间差异大的可能性更高。此外，可以通过解毒寡核苷酸与适配体活性碱基序列形成互补配对，破坏适配体功能而调节其活性。 

适配体与抗体对比（来源：Nature Reviews Drug Discovery） SELEX技术可以从随机单链核酸序列库中筛选出特异性与亲和力的适配体。该技术的初始文库是单链DNA或RNA文库，由1014~1016个随机的长度为20～100个核苷酸序列的寡核苷酸组成，两端为固定引物序列，中间有一个随机区域。初始文库与靶标物质孵育后，结合的寡核苷酸从未结合序列中分离并通过PCR扩增，得到的富集池投入下一轮的筛选，不断循环最终找到高亲和力适配体。 

SELEX技术筛选高亲和力适配体流程（来源：中国生物化学与分子生物学报） 

适配体疗法的挑战

目前，全球仅1款抗VEGF适配体药物培加他尼获批上市（目前由于疗效与销量原因已退市）。适配体是核苷酸多聚物，体内疗效严重受制于其固有的理化特性。这类药物代谢不稳定，肾滤过快，从血浆分布到组织（如肝脏、脾脏）的时间短，此外还有非特异性免疫活化等问题，因此体内药代动力学特性不理想。在适配体的开发过程中面临着许多挑战，这项技术有待继续研究。 

核酸酶降解   

未修饰的适配体易受核酸酶作用，体内半衰期短（＜10 min）。目前，临床试验中大多数适配体都在2’位置以-F、-NH2、-OCH3修饰，在3’端以反式胸苷修饰，提高抗核酸酶能力并提高亲和力。实践中，有2种不同的方式可以将修饰的核苷酸引入适配体中，即in-SELEX 和SELEX后优化（post-SELEX）技术。 in-SELEX技术中，利用修饰后的核苷酸作为底物用于合成适配体。但是，这种方法只适用于氨基嘧啶、氟嘧啶、O-甲基核苷酸和锁核酸（LNA）等少数几种修饰核苷酸。  

in-SELEX技术示意图（来源：Journal of The American Chemical Society） post-SELEX技术是在固相合成过程中，在适配体不同位置（如碱基、糖环、磷酸基团等）引入修饰。有时将同时引入多个修饰基团以获得最佳识别能力。然而，适配体的识别性能高度依赖初始适配体折叠结构，这种方式可能导致修饰后的适配体折叠结构变化，影响其识别的亲和力与特异性。因此，需要对修饰基团与位点精准调控，保证适配体的预期功能。需要尤其注意，这种方式没有通用的规则，需要不断地调整与优化。   

肾滤过   

质量为6 – 30 kDa的适配体平均直径小于 5 nm，会经肾脏滤过而快速排出。为克服肾滤过并延长体循环时间，适配体通常需要与一个较大分子量的修饰基团偶联，如聚乙二醇（PEG）、胆固醇、蛋白质、脂质体等，修饰后的适配体分子量需高于肾小球临界值（30–50 kDa）。PEG修饰的培加他尼静脉注射和皮下注射的血浆半衰期分别为9.3 h和12 h，而在玻璃体中则长达94 h。  

毒性   

关于适配体毒性的资料有限，临床中也很少观察到严重的不良反应。适配体潜在的毒性主要来源包括适配体表面多价阴离子、非预期的组织蓄积、化学修饰或偶联导致的风险或非特异性免疫激活，尤其是在连续服用适配体药物的情况下。 

适配体分子表面有多个负电荷，容易与血浆蛋白质发生非特异性结合，被非靶组织高度摄取，从而导致不必要的副作用，并降低疗效。 

化学修饰是一把双刃剑，一方面可提高适配体的稳定性与结合能力，但非天然核苷酸可导致毒性或免疫原性。例如，LNA修饰的核苷酸可导致严重的肝毒性。因此，必须根据适配体预期的应用场景谨慎地选择化学修饰官能团。 

不良反应也可能与适配体药物的处方有关。例如，Regado Biosciences开发的抗血栓适配体药物REG1临床III期试验中，由于受试者体内预先存在抗PEG抗体，REG1药物结构中的PEG引发了严重的过敏反应。高亲脂性分子通常导致非特异性的肝脏蓄积，有可能引发肝毒性。总之，在适配体处方开发中，必须谨慎选择处方。 

适配体研究进展 

基于适配体的疗法主要分为3类： 1）将适配体作为拮抗剂，阻断疾病相关靶点之间的相互作用； 2）将适配体作为激动剂，激活靶受体功能； 3）将适配体作为靶头，将其他药物运输到靶组织。   

作为拮抗剂   

破坏病理蛋白功能的抑制性适配体可作为治疗性拮抗剂。目前已开发出针对眼科疾病、肿瘤、心血管疾病、神经退行性疾病和传染病的适配体药物。 

尽管这类药物具有极佳的亲和力和特异性，由于设计或处方不理想，这些适配体无法充分发挥其治疗潜力。适配体偶联物的生物分布取决于分子大小、电荷和其他理化性质，合理的设计与处方至关重要。 

 惰性抗体。 培加他尼最早开发用于治疗肿瘤。研究表明，培加他尼具有抑制VEGF诱导的血管通透性和肿瘤生长的能力。但早期研究中，这种药物抗肿瘤效果未达到预期。为了改善这种药物体内药代特征，将靶向可替宁的抗体与偶联可替宁的培加他尼结合在一起，肿瘤浸润性好，血清半衰期延长，具有良好的抗肿瘤能力。因此，这项研究表明，将适配体与抗体偶联可能是抗肿瘤药物开发的新思路。 

 胆固醇。 研究表明，胆固醇可以减少肾脏滤过，通过受体介导的内吞增加肝细胞摄取。偶联胆固醇的抗丙肝NS5B蛋白适配体的临床前实验结果表明，全身给药（口服或注射，进入血液后再作用于病变部位的给药方式）耐受性良好，与未偶联的适配体相比，半衰期延长2倍。 

 纳米颗粒。 抑癌蛋白p53中单个氨基酸突变（R175H）导致野生型p53失活，影响了多个肿瘤相关信号通路。利用SELEX筛选的可以区分p53-R175H和野生型p53的高特异性RNA适配体可以抑制肺癌细胞的迁移与侵袭。为了抑制该适配体降解，以聚乙二醇化聚乙烯亚胺修饰该适配体形成的纳米制剂，可以抑制药物降解，动物模型中具有良好的抗肿瘤活性。 

 水凝胶Pluronic。 血管平滑肌细胞（VSMC）的迁移和增殖在心血管疾病的发展中起着关键作用。以SELEX筛选的适配体对VSMC具有高度特异性，可以抑制VSMC迁移。这种RNA适配体通过水凝胶Pluronic（一种用于透皮给药的双相胶束系统）制成制剂时，可有效抑制小鼠体内新生内膜形成。上述结果表明，水凝胶Pluronic帮助适配体递送到血管壁。 

 多聚体。 目前，肝素仍是最佳的抗凝药物。而通过将针对不同凝血酶的适配体组合给药，可以实现与肝素相当的预防纤维蛋白凝块的效果。然而，多种适配体联合给药的鸡尾酒疗法大大增加了临床开发的复杂性与成本。未被批准的每一个适配体及其联合给药方式都必须经历临床前与临床I期试验，确保每种组分的安全性。而将单个适配体多聚化形成一个单元可能是一种潜在的替代策略。一种同时靶向2种不同凝血机联蛋白的二价适配体在人血中抗凝效果与肝素相当。   

作为激动剂   

 4-1BB RNA适配体。 通过互补连接基团，2个单价4-1BB适配体变成了一个二价分子。单价和二价适配体都可以与4-1BB阳性细胞结合，但只有二价适配体才可以在体内激活T细胞，促进肿瘤排斥反应。由于共刺激活性非常依赖适配体的空间排列与距离，必须对其予以细致的结构设计。为了触发4-1BB受体交联，适配体间距离需控制在5–18 nm（即4-1BB特异性抗体2个可变结构域之间的距离）。因此，以一个21 bp的双链连接基团结合2个4-1BB适配体，将二者的距离控制在7.1 nm，这可以让二价适配体以正确的构象与受体结合。  

将2个4-1BB适配体的3’端结合到21 bp的核苷酸互补连接基团上（来源：Nature Reviews Drug Discovery） 

 CD28 RNA适配体。 从2-氟嘧啶修饰的RNA文库中分离出2种特异性结合小鼠CD28的RNA适配体，这2种适配体的单价和二聚体的体内活性不同。单体形式中，CD28Apt2适配体发挥拮抗剂功能，阻止CD28与其主要配体B7.2相互作用，阻断共刺激信号；另一种CD28Apt7适配体单价形式是非活性的。而分别将这2种适配体组成二价缀合物时，它们都发挥了激动剂作用。这项研究表明，通过合理结果设计可利用适配体发挥不同的功能；而这种双重特性还未在治疗性抗体中观察到。   

作为递送载体   

细胞特异性的适配体可以与治疗药物（如siRNA、miRNA、治疗性适配体、化疗药物）或其他药物载体（有机或无机纳米载体）结合，利用适配体的高亲和力与特异性，提高药物在靶组织的局部浓度与治疗效果。 

适配体-治疗性寡核苷酸缀合物。人类前列腺特异性膜抗原（PSMA）是一种在人前列腺癌和血管内皮中高度表达的跨膜蛋白，目前已开发出PSMA特异性适配体。通过将PSMA适配体与各种治疗性寡核苷酸偶联，缀合物可以特异性靶向表达PSMA细胞，有效抑制细胞和动物模型中的促癌基因活性。 

为实现不同的功能，还可将该PSMA适配体与不同的活性单元组合。例如，PSMA适配体与抗DNA激活蛋白激酶的shRNA偶联，可以发挥RNAi活性；将2个生物素化PSMA适配体与2个生物素化siRNA同时结合到一个链霉亲和素偶联平台上，多价缀合物可以选择性地递送siRNA到PSMA阳性细胞中；PSMA适配体还可以与治疗性适配体结合，例如将上述二价4-1BB适配体与PSMA适配体通过互补连接序列偶联产生的缀合物的体内抗肿瘤活性比未偶联4-1BB适配体更强。 

此外，适配体还可与蛋白质、小分子抗肿瘤药物等活性基团偶联，提高药物靶向性、降低毒副作用。 

适配体修饰作为递送载体的纳米材料。适配体除了与药物直接偶联之外，还可修饰装载不同药物的纳米载体。目前，适配体已成功应用于金纳米粒颗粒、氧化铁纳米颗粒、量子点、脂质体、胶束等药物载体的靶向递送。纳米载体中封装有治疗性药物 （如治疗性寡核苷酸或化疗药物） 、靶向基团 （如细胞特异性适配体） ，某些情况下还有造影剂 （如荧光染料或放射性药物） 。纳米载体表面的适配体与细胞表面的靶受体结合后，通过受体介导的内吞途径进入细胞，经历溶酶体逃逸步骤进入细胞质，释放治疗药物，随后发挥药理活性。 

适配体疗法的临床进展 

截至目前，全球处于临床试验阶段的适配体接近10种，具体适应症包括黄斑变性、凝血、肿瘤和炎症等。本文结合医药魔方 NextPharma数据库进行盘点 。   

黄斑变性   

目前正在临床试验阶段接受评估的黄斑变性适配体药物主要包括靶向补体成分5（C5）的avacincaptad pegol和靶向成纤维生长因子-2的RBM-007。 

avacincaptad pegol是由Iveric Bio和Archemix推出的抗C5适配体药物，其与雷珠单抗联合给药用于治疗湿性年龄相关性黄斑变性（AMD）的临床试验正处于II期。补体系统在视网膜生物学和AMD发病机制中具有重要作用。补体系统的几种主要组分蛋白，如补体组分3（C3）、C5和膜攻击复合物（MAC），通常在人眼脉络膜和玻璃体的毛细血管中表达。这些成分诱导VEGF表达，从而加速新生血管性AMD。抑制C5激活可以预防AMD相关的炎症介导的组织损伤。avacincaptad pegol是一种RNA适配体，可抑制C5的蛋白水解激活。该药物结构中包含2ʹ-氟嘧啶、2ʹ-甲氧基嘌呤、反向脱氧胸腺嘧啶核苷帽（idT，抑制血清核酸酶活性）和40 kDa PEG，以进一步提高其抑制活性与血浆半衰期。 

2018年11月公布的临床IIa期试验结果表明，联合用药6个月后受试者总体耐受性良好，最常报告的不良反应为眼部注射导致，而与联合治疗无关。60%接受联合治疗的患者视力提高3行或3行以上或15个早期治疗糖尿病视网膜病变研究（ETDRS）字母。 

RBM-007是由Ribomic与AJU Pharma联合开发的产品。据Ribomic公司官网，这种药物不仅抑制血管生成，而且可抑制视网膜瘢痕（从目前可用药物中受益的患者在大约两到三年后疗效也会降低，并再次面临视力丧失的风险，这一现象可能与视网膜瘢痕有关）形成。今年3月公布的最新临床试验结果表明，与抗VEGF药物相比，RBM-007在改善AMD患者的最佳矫正视力和视网膜解剖结构方面更有效。   

抗肿瘤   

进入临床试验阶段的抗肿瘤药物主要包括 RNA适配体药物olaptesed pegol和DNA适配体药物AS1411。 

AS1411的临床II期试验结果表明，该药物疗效不佳，在未经选择的患者中仅1例带有成纤维细胞生长因子受体2和雷帕霉素机制性靶点突变的患者对药物具有响应，目前该药物在肾细胞癌和急性髓系白血病适应症的临床试验已经终止。目前，Qualigen Therapeutics, Inc.试图将其开发作为治疗COVID-19的药物，目前正在IND阶段。 

olaptesed pegol是一种L型适配体药物，靶向趋化因子(C-X-C 基元)配体12（CXCL12）。CXCL12在肿瘤增殖、新血管形成和转移中起着重要作用。olaptesed pegol具有2种结合位点，与对应靶标结合后可以破坏CXCL12活性，调节肿瘤微环境，在研适应症包括胶质母细胞瘤、结直肠癌、胰腺癌和慢性淋巴细胞白血病等。2022年ASCO会议公布的最新临床试验结果显示，将放疗与olaptesed pegol的联合疗法具有良好的安全性与耐受性，没有出现剂量限制性毒性，也没有出现患者死亡。在olaptesed pegol治疗期间，9例处于基线水平的患者中，8例出现病灶响应，其中4名达到部分缓解。   

凝血   

目前处于临床试验开发阶段的代表性凝血类药物是由Duke University、Basking Biosciences和Ohio State University联合开发的DTRI-031。 DTRI-031可有效抑制冯维勤布兰德因子A1结构域，在动物模型中有效疏通的闭塞动脉。BB-025是DTRI-031的解毒剂，在出血状况下可中和DTRI-031活性，数分钟内可止血，这使得医生可以及时干预并解决出血问题，降低下游发病率与死亡率。 

DTRI-031可改善中风症状（来源：Basking Biosciences官网） 此外，全球处于临床开发阶段的在研适配体疗法还有心血管领域的BC007 （用于治疗扩张型心肌病；由Berlin Cures研发） 与BT200 （用于治疗动脉疾病；由瑞博生物与Band Therapeutics合作研发） ，以及处于临床I期的靶向C5a靶点的AON-D21 （具体适应症尚未公布；由Aptarion Biotech研发） 。 

总结与展望 

目前，适配体药物研发进度与商业化程度不理想的原因可能包括以下几个因素。 早期排他性的SELEX技术知识产权限制了这项技术的推广； 不同于抗体开发的成熟路径，适配体开发的人才、资本和知识储备（处方、药代动力学特性、药效学和毒理学）都不完善。 而基于RNA疗法的设计与处方挑战仍没有解决，这些问题对适配体药物的成药性与未来发展都非常关键。 

但是，基于适配体药物的特性，这类药物仍有巨大的治疗潜力。适配体不仅具有小分子的灵活性，可以靶向大分子抗体无法结合的位点，同时具备抗体的特异性。因此，这些特性使适配体药物在抗菌药物、抗病毒药物、肿瘤免疫疗法或靶向治疗等细分市场中有望分一杯羹。例如，快速的适配体筛选技术可以同步病毒出现与突变，迅速开发相关疫苗；适配体特异性与细胞表面受体结合的特性可以改善纳米载体的靶向性与药代动力学特征。 

目前，适配体药物的临床潜力仅展现其冰山一角。随着更多研究人员促进适配体合理药物设计，下一代基于适配体开发的治疗手段将具备优越的生物学功能与药代动力学特性。此外，市场对于更具性价比治疗手段的需求，合成与处方工艺的技术进步，SELEX专利到期等因素都将为这一前景广阔的药物形式提供强大的发展动力。 

参考资料： 

[1]  韩冬梅 et al. 核酸适配体在肿瘤免疫治疗中的应用.中国生物化学与分子生物学报. 2022. 

[2]  Jiehua Zhou. Aptamers as targeted therapeutics: current potential and challenges. Nature Reviews Drug Discovery. 2016. 

[3]  Stefan Jäger et al. A Versatile Toolbox for Variable DNA Functionalization at High Density. Journal of the American Chemical Society. 2005. 

[4] https://www.businesswire.com/news/home/20181112005203/en/Ophthotech-Announces-Results-Phase-2a-Safety-Trial 

[5] https://www.globenewswire.com/news-release/2021/07/14/2262672/0/en/Qualigen-Therapeutics-Inc-Announces-Submission-of-Investigational-New-Drug-IND-Application-for-QN-165-for-the-Treatment-of-COVID-19.html 

[6]  https://meetings.asco.org/abstracts-presentations/208828 

[7]  https://www.ribomic.com/eng/pipeline/rbm007.php 

[8]  https://www.baskingbiosciences.com/our-solution/ 

[9]  Shuanghui Yang et al. Oligonucleotide Aptamer-Mediated Precision Therapy of Hematological Malignancies. Molecular Therapy Nucleic Acids. 2018.