科研丨山一大＆华中大＆山大: 多组学分析类风湿性关节炎中微生物失调和代谢紊乱的阶段特异性作用(国人佳作)

编译：微科盟皮皮，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读  

类风湿性关节炎(RA)是一种进行性疾病，分为四个阶段，其中肠道微生物群与发病有关。我们旨在研究RA中微生物失调和代谢紊乱的阶段特异性作用。本研究调查了根据2010年RA分类标准分为四个阶段(I-IV期)的76例RA患者、19例骨关节炎(OA)患者和27例健康个体的粪便宏基因组和血浆代谢组的阶段性特征。为了验证关节滑液中的细菌侵袭，对来自RA四个阶段的271名患者进行了16S rRNA基因测序、细菌分离和扫描电镜检查。首先，单形拟杆菌(Bacteroides uniformis)和Bacteroides plebeius的减少削弱了糖胺聚糖代谢(p<0.001)，连续四个阶段损伤关节软骨。其次，大肠杆菌的升高增强了II期和III期的精氨酸琥珀酰转移酶途径(p<0.001)，这与类风湿因子的增加有关(p=1.35×10-3)，并可能导致骨丢失。第三，异常高水平的甲氧基乙酸(p=1.28×10-8)和半胱氨酸-S-硫酸盐(p=4.66×10-12)分别在II期抑制成骨细胞，在III期增强破骨细胞，促进了骨侵蚀。第四，肠道通透性的持续增加可能导致IV期关节滑液的肠道微生物侵入。综上所述，临床微生物干预应考虑RA分期，微生物失调和代谢紊乱呈现出不同的模式，并发挥阶段特异性作用。本研究为从分期的角度理解肠道-关节轴提供了新的见解，为类风湿性关节炎的预后和治疗开辟了新的途径。  

论文ID

原名：Stage-specific roles of microbial dysbiosis and metabolic disorders in rheumatoid arthritis

译名：类风湿性关节炎中微生物失调和代谢紊乱的阶段特异性作用

期刊：Annals of the Rheumatic Diseases

IF：27.973

发表时间：2022.8.19

通讯作者：韩金祥，宁康，张磊

通讯作者单位：山东第一医科大学(山东省医学科学院)；华中科技大学；山东大学

DOI号：10.1136/ard-2022-222871

实验设计

结果

1 阶段特异性微生物分类特征

从宏基因组数据中总共获得了231种分类微生物物种，并与健康对照相比，测试它们在RA各个阶段的变化(参见在线补充图S1，表S1-S5)。RA进展中升高的物种主要来自厚壁菌门(Firmicutes)和放线菌门(Actinobacteria)，而减少的物种主要来自拟杆菌门(Bacteroides)(q＜0.1)。与健康对照组相比，我们发现某些微生物在RA分期中没有保持改变。与健康对照相比，除RAS1外，整个RA分期(RAS2: p=7.16×10-3，RAS3: p=3.70×10-3，RAS4: p=9.15×10-4)均保持升高。此外，我们注意到29个物种只在特定阶段发生改变(见在线补充表S1-S5)。我们发现，产气柯林斯菌(Collinsella aerofaciens)仅在RAS1中升高(p=0.043)。此前有报道称，当将产气柯林斯菌接种到CIA易感小鼠体内时会产生严重的关节炎，而体外实验表明，产气柯林斯菌可以增加肠道通透性并诱导IL-17A表达，IL-17A是一种参与RA发病的关键细胞因子。RAS1中产气柯林斯菌的升高可能导致肠道屏障完整性的早期破坏，微生物产物的易位将引发随后的临床关节炎。此外，发现感染可导致骨髓炎的Veillonella parvula仅在RAS3中升高(p=0.027)。在RAS4中发现了Eggerthella lenta (p=0.018)和长双歧杆菌(Bifidobacterium longum) (p=0.022)的特异性升高。据报道灌胃E. lenta可增加肠道通透性并产生促炎细胞因子。我们还发现了仅在OA中发生改变的物种，如与脊柱关节炎严重程度正相关的Dialister invisus升高(p=0.041)。这些阶段特异性改变物种有可能作为特定RA阶段干预的靶标。

表1 多组学队列(122名参与者)粪便采集的一般特征。

ACPA阳性定义为浓度大于5 μL/mL。根据2010年RA分级标准总结分类评分：A，关节受累；B，血清学；C，急性期反应物；D，症状持续时间。ACPA，抗瓜氨酸蛋白抗体；CRP，C反应蛋白；ESR，红细胞沉降率；HC，健康对照；OA，骨关节炎；RA，类风湿性关节炎；RAS1-4，RA的第一至第四阶段；RF，类风湿因子。

2 阶段特异性微生物功能特征

接下来，我们试图检测RA各个阶段的微生物功能障碍。我们将4,047,645个宏基因组基因分为6224个KOs和404个KEGG模块。我们确定了12个与RA或OA显著相关的KEGG模块(q＜0.1或qpartial<0.1，参见在线补充图S2)，并展示了它们在各个阶段的变化(图1A)。然后，我们使用留一法(leave-one-out)分析来确定最能驱动这些KEGG模块与RA或OA相关性的MGS(图1B，在线补充图S3)。

本研究发现在四个RA阶段和OA中糖胺聚糖(CAG)代谢明显下降。主要表现为硫酸皮肤素(DS)降解的K01197(透明质酸氨基葡萄糖苷酶)和硫酸乙酰肝素(HS)降解的K10532(乙酰肝素-α-氨基葡萄糖苷N-乙酰转移酶)显著降低(p<0.05，图1A)。4-硫酸软骨素是许多结缔组织(如软骨、骨骼和皮肤)细胞外基质的主要成分。我们发现，DS降解的显著减少会抑制4-硫酸软骨素的产生(图1B)，这可能会损害关节软骨的机械性能。此外，HS降解的显著减少可能是RA和OA患者血浆HS水平升高的潜在原因，这可能通过调节蛋白酶活性促进关节炎的进展。DS和HS降解的驱动物种分别为MGS Bacteroides uniformis(单形拟杆菌)和MGS Bacteroides plebeius。我们发现与K01197相关的MGS B. uniformis基因在RAS2中缺失最多，而与K10532相关的MGS B. plebeius基因在RAS3和RAS4中缺失最多(图1B)。上述结果表明，分别由单形拟杆菌和B. plebeius驱动的DS降解和HS降解中微生物功能的减少可能通过损伤关节软骨的方式促进RA和OA的发生。

本研究还发现了与炎症相关的微生物功能升高，如先前报道的抗坏血酸降解。在本研究中，我们发现大多数与抗坏血酸降解相关的KOs在RA阶段和OA中保持较高水平，尤其是在RAS2和RAS3中(p<0.05，图1A)。RAS1中K02821 (磷酸转移酶系统)、K03475 (磷酸转移酶系统)、K03476 (L-抗坏血酸6-磷酸内酯酶)和K03479 (L-核酮糖-5-磷酸3-差向异构酶)基因主要由MGS Escherichia coli(大肠杆菌)驱动(图1B)。抗坏血酸降解增强可能导致RA23患者的抗坏血酸缺乏，并发现与多种血浆细胞因子呈正相关(q<0.1或qpartial <0.1，参见在线补充表S6)，例如IL-1β (p=5.44×10-4)、TNF-α (p=6.59×10-4)和IL-6 (p=1.12×10-3)。此外，为了证实抗坏血酸对RA进展的影响，我们检测了(1)正常DBA/1小鼠、(2)患有CIA的DBA/1小鼠和(3)患有CIA并灌胃抗坏血酸的DBA/1小鼠的血浆TNF-α水平和IL-6水平、骨CT扫描和骨密度。我们发现，与未灌胃抗坏血酸的CIA小鼠(1.53±0.013 g/cm3)和正常组(1.61±0.021 g/cm3，见在线补充图S4)相比，向CIA小鼠灌胃3个月抗坏血酸可以防止TNF-α和IL-6水平增加一半，抑制骨破坏，并维持骨密度(1.58±0.0034 g/cm3)。

对于其他微生物功能的升高，由MGS大肠杆菌驱动的反式肉桂酸降解，其中大多数KOs在RAS2中显著升高，也与多种细胞因子相关(q<0.1或qpartial <0.1，参见在线补充表S6)，例如IL-13 (p=1.63×10-5)、IL-1β (p=2.87×10-5)和IL10 (p=4.10×10-5)。此外，发现由MGS大肠杆菌驱动的精氨酸琥珀酰转移酶途径主要在RAS2和RAS3中显著升高(图1)。L-精氨酸能够分别通过抗炎机制或一氧化氮的产生来预防氧化锌纳米颗粒或环孢素A引起的骨丢失。精氨酸琥珀酰转移酶途径和反式肉桂酸降解均与类风湿因子升高呈正相关(p=1.35×10-3)。综上所述，微生物功能障碍主要通过损伤骨组织和增强炎症反应促进RA进展。与炎症相关的微生物功能障碍在RAS2和RAS3中非常活跃，主要由大肠杆菌驱动。

图1 阶段特异性微生物功能特征。与健康个体(n=27)相比，评估每个关节炎阶段RAS1 (n=15)、RAS2 (n=21)、RAS3 (n=18)、RAS4 (n=22)和OA (n=19)的基因丰度是否升高或减少。(A) KEGG模块中与关节炎显著相关的KO基因的相对丰度(q<0.1或qpartial <0.1，在线补充图S1)。显示了流行率为5%或更高的KO基因。(B)在(A)中涉及特定KEGG通路模块的KO基因在KEGG通路图中显示。通路中的每个方框代表一个KO基因，与健康个体相比，在任何阶段都用红色表示升高，蓝色表示减少。条形图显示了五个组(健康组(H)、RAS1组(S1)、RAS2组(S2)、RAS3组(S3)、RAS4组(S4)和OA)中样本的平均相对基因丰度，并根据值着色。每个KO基因由圆圈表示的MGS基因组成。圆圈的大小和颜色与MGS基因的相对丰度成正比。MGS基因归为一行，用分类学名称表示。显示了最能驱动KEGG模块与关节炎类型相关性的三个MGS。在所有图中，显著变化如下所示:升高+++，p<0.005；++，p<0.01；+，p<0.05；减少－－－，p<0.005；－－，p<0.01；－，p<0.05；Mann-Whitney-Wilcoxon检验。KEGG，京都基因与基因组百科全书；KO，KEGG直系同源物；MGS，宏基因组物种；OA，骨关节炎。

3 微生物侵入关节滑液

接下来，我们研究了是否或在哪个阶段发生了关节滑液的微生物入侵。增强的肠道通透性可能使微生物及其产物易位，从而触发免疫反应。因此，我们推测肠道微生物可能通过肠道-关节轴侵入RA患者的关节滑液。为了验证这一点，我们对来自另一个队列的271例RA四个分期患者的滑液样本进行了16S rRNA基因测序，包括RAS1 (n=52)、RAS2 (n=66)、RAS3 (n=67)和RAS4 (n=86)。值得注意的是，我们无法在RAS1、RAS2或RAS3样本中获得足够的细菌DNA进行测序，但我们可以在RAS4样本中鉴定出许多微生物(参见在线补充图S5)。我们发现关节滑液中的微生物大部分来自变形菌门和厚壁菌门，在粪便宏基因组数据中也可以检测到共98个属(参见在线补充表S7)。此外，我们可以在大多数滑液样本中鉴定出E. lenta和B. longum，在多组学队列中的RAS4患者的粪便宏基因组中观察到这两个物种均升高(参见在线补充表S4)。此外，在RAS4患者的大部分滑液样本中也发现了与RA高度相关的Prevotella copri。然后我们在每个RA阶段随机选择6个滑液样本进行细菌分离。我们只能从三个RAS4的滑液样本中分离出细菌。然后，我们在每个滑液样本中选取三个单菌落进行测序。9个菌落中有5个被鉴定为Clostridium sporogenes菌株，3个被鉴定为鹑鸡肠球菌(Enterococcus gallinarum)菌株，1个被鉴定为弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)(参见在线补充表S8)。有趣的是，18%的RA患者的粪便宏基因组数据中也能检测到鹑鸡肠球菌和弗氏柠檬酸杆菌。随后，我们通过扫描电镜观察了相应的滑液样本，发现了类似细菌的杆状或球形物质(图2)。综上所述，这项多方面的研究提供了前所未有的证据，支持在RA第四阶段关节中存在微生物侵袭(图2)。

图2 关节滑液扫描电镜图。

4 阶段特异性代谢组学特征

然后，我们引入了代谢组学数据，并对232个微生物组物种、6224个KOs和277种代谢物进行了随机森林算法，以测试它们对RA和OA各个阶段的诊断潜力(图3A-E)。代谢物在区分4个RA阶段或OA样本与健康样本时表现出最佳的受试者工作特征曲线(AUROC)下面积，AUROC范围为0.974 ~ 0.998。物种和KO水平的其他特征表现出较弱的判别能力，AUROC的范围分别为0.760 ~ 0.838和0.799 ~ 0.852。与健康状态相比，代谢物最显著的变化是RAS1中DL-乳酸和甘氨酸-谷氨酸显著升高(p=2.15×10-6, p=4.70×10-4)，RAS2中N,N-二甲基苯胺的减少和甲氧基乙酸增加(p=4.60×10-8, p=1.28×10-8)，RAS3中半胱氨酸-S-硫酸盐增加(p=4.66×10-12)，RAS4中半乳糖醇和3α-甘露二糖增加(p=5.71×10-5，p=5.68×10-4)，以及OA中N,N-二甲基苯胺和甘氨酸-谷氨酸增加(p=2.00×10-7, p=1.74×10-3)。主要的代谢紊乱与RA的发病机制密切相关，对RA分期具有很大的诊断潜力。

此外，代谢紊乱不仅可以区分特定的RA分期与健康对照，还可以区分其他RA分期或OA(图3F)：RAS2中的甲氧基乙酸(p=1.68×10-4)或RAS3中的半胱氨酸-S-硫酸盐(p=2.42×10-4)或RAS4中的半乳糖醇和3α-甘露二糖(p=9.37×10-3，p=4.89×10-3)分别高于所有其他RA分期和OA。甲氧基乙酸对成骨细胞具有抑制作用，可导致骨髓细胞数量减少。此外，半胱氨酸-S-硫酸盐是谷氨酸的结构类似物，可作为N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDA-R)的激动剂，NMDA-R在破骨细胞中的表达和功能参与骨吸收。因此，RAS2中甲氧基乙酸的显著升高可能会阻碍成骨细胞，而RAS3中半胱氨酸-S-硫酸盐的显著升高可能会促进破骨细胞的形成。成骨细胞和破骨细胞之间的失衡会促进临床RA第三阶段发生骨侵蚀。此外，OA中的DL-乳酸低于所有RA分期(p=0.037)，这可能有助于早期RA与OA的临床鉴别。

图3 RA阶段的多组学诊断潜力。对RAS1 (A)、RAS2 (B)、RAS3 (C)、RAS4 (D)和OA (E)中的6224个KOs、232个微生物物种和277种血浆代谢物进行随机森林分析，显示了最具判别性的5个代谢物的Gini重要性。方框表示第一和第三四分位数之间的IQR，其中的线表示中位数。须分别表示第一和第三四分位数的1.5 IQR内的最低值和最高值。方框用特定的颜色标记，以显示与健康组相比，每个关节炎阶段特征的显著升高(p<0.05，红色，Mann-Whitney-Wilcoxon检验)或减少(p<0.05，蓝色，Mann-Whitney-Wilcoxon检验)。使用微生物物种、KOs或代谢物绘制随机森林模型的ROC曲线，并通过10次随机10倍交叉验证计算AUC。曲线的颜色表示所使用特征的类别。(F)点图显示了血浆代谢物的阶段特异性丰度或浓度(平均值±SE)，其在(A-E)中指定。连接四个RA阶段以显示方差。与健康组相比，如果特征显著升高(红色)或显著减少(蓝色)，点的颜色会有所不同。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.005；Mann-Whitney-Wilcoxon检验。AUC，曲线下面积；KEGG，京都基因与基因组百科全书；KO，KEGG直系同源物；OA，骨关节炎；RA，类风湿性关节炎；ROC，受试者工作特征。

讨论

本研究结果揭示了肠道微生物组和血浆代谢组的动态变化，以及它们在RA发病机制中跨越四个连续阶段的持续作用(图4)。此外，我们证明了关节滑液的微生物入侵发生在RA的第四阶段。

本研究中使用的样本可以很好地代表RA各阶段的肠道微生物组。我们医院每年有数万名关节炎门诊患者，从2017年到2020年，我们不断收集诊断为RA各个阶段的患者的样本。考虑到临床干预对肠道微生物群的潜在影响，在本研究中，我们只招募了1个月内未接受治疗且处于活动期的患者样本。因此，本文所描述的微生物菌群失调和代谢紊乱可以作为未来RA各阶段研究的重要参考。

临床微生物干预应考虑RA分期。我们发现每个RA阶段都有其特殊的升高或减少的微生物，这些微生物在RA发病机制中发挥作用(图4A)。因此，正如许多研究所做的那样，在没有分期信息的情况下，一般报道RA的微生物变化，可能不足以作为临床指导。例如，仅在第一阶段升高的C. aerofaciens的早期抑制可能有助于防止肠道通透性增加。此外，在第二和第三阶段抑制大肠杆菌可以帮助维持作为骨丢失抑制剂的L-精氨酸的含量，以及抗炎抗坏血酸的含量。此外，某些物种可能需要跨阶段干预，因为其在整个RA进展过程中会耗尽。B. uniformis的跨阶段修复有助于维持4-硫酸软骨素的含量，以保持关节软骨的机械性能。

此外，代谢变化在整个RA进展过程中保持相当大的程度，尽管我们发现这些代谢物中的某些在特定阶段需要更高的优先干预。在RA第二阶段，甲氧基乙酸的异常升高可能对成骨细胞产生抑制作用，并导致骨髓细胞减少(图4B)。受抑制的成骨细胞为下一阶段发生的骨侵蚀埋下伏笔。在第三阶段，半胱氨酸-S-硫酸盐的显著升高可能通过NMDA-R相互作用增强破骨细胞。成骨细胞和破骨细胞之间的失衡会促进第三阶段发生的骨侵蚀，并持续到RA后期。甲氧基乙酸可能是治疗RA第二阶段患者的靶向代谢物，并对即将到来的第三阶段起到预防作用。

图4 从多组学角度探讨RA分期的潜在发病机制。(A)肠道微生物失调通过损伤骨组织和增加炎症在RA发病中发挥作用的潜在机制。从图1B中提取了驱动物种、微生物功能障碍及相关代谢物。代谢物的红色或蓝色框表示根据KEGG图推测的代谢物的升高或减少。虚线表示推测的微生物和代谢变异对关节炎发病的影响。(B)微生物失调和代谢紊乱对连续阶段RA进展的最具代表性的影响。KEGG，京都基因与基因组百科全书；RA，类风湿性关节炎。

本研究的结果表明，细菌侵入关节滑液发生在RA的第四阶段(图4B)。关节滑液通常被认为是无菌的，事实上，在前三个阶段，我们既没有从滑液中提取足够的DNA，也没有从滑液中分离出细菌。而在第四阶段，我们成功获得了细菌16S reads，分离了细菌，并在扫描电镜下观察到呈棒状或球形的细菌状物质。此外，在多组学队列中，我们发现两种粪便微生物仅在RA的第四阶段升高，E. lenta和B. longum，它们在关节滑液中的存在得到了另一个队列的验证。这可能是由于肠道屏障持续损伤的积累，微生物和微生物代谢物随后会通过血液转移到关节。因此，对于处于RA第四阶段的患者，除了常规的药物治疗外，对关节滑液中的微生物进行特定的治疗可以改善关节微环境，减少滑膜炎症，并抑制潜在的细菌作用。

本研究也存在局限性。首先，对单个个体在其RA发展过程中的长期随访调查可能会加强本研究的结论。其次，目前还不清楚细菌遗传物质是如何从肠道转移到关节的。它可能通过血液或细胞外囊泡或两者兼而有之的细菌传播实现。第三，本文提出的微生物代谢失调与RA之间的联系，可以为未来RA发病机制的实验提供指导。最后，对滑液微生物组和代谢组的进一步研究有可能揭示更复杂的RA发病机制。

综上所述，本研究证明了微生物和代谢物在RA发病的四个连续阶段的作用。对于RA的预后和预防，有必要对微生物失调和代谢紊乱进行阶段特异性干预。

原文链接：

https://ard.bmj.com/content/early/2022/08/19/ard-2022-222871

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