Nature Reviews | 重回视野的表型药物开发，未来如何？

药物发现主要有两种方式，一种是最早的基于表型的药物发现（Phenotypic drug discovery, PDD），新药物是通过观察其对人类或疾病模型的治疗效果验证筛选的。随着20世纪80年代分子生物学革命和21世纪人类基因组时代的到来，精准医疗更注重特定的分子机制。现在设计药物常常针对某一个与疾病机理高度相关的特定靶点，即基于靶点的药物发现（Target-based drug discovery, TDD）。

然而，自2011年以来，PDD方法又重新受到重视。因为人们发现，1999年至2008年FDA批准的大多数first-in-class药物是在没有药物靶标假设的情况下凭经验发现的[1]。如治疗脊髓性肌肉萎缩症的risdiplam和branaplam、治疗疟疾的KAF156等（图1）。尽管PDD已作为一成熟领域不断发展，但仍存在一些弊端。本文详细讨论了PDD的发展和对药物发现概念的启示，并提出了持续面临的挑战和解决方法[2]。 

图1：表型药物发现谱 

 01   PDD重塑药物发现的概念  

1.扩大“可药用”的靶点范围

PDD以分子靶点不可知的方式对疾病相关生物系统进行化学验证，这一经验优先、生物学优先的策略将治疗生物学和先前未知的信号通路、分子机制和药物靶点联系起来。

以囊性纤维化的治疗、来那度胺的发现为例：囊性纤维化由囊性纤维化跨膜传导调节器（CFTR）基因突变引起[3]，使用野生型或CFTR变异的细胞系进行靶向不可知化合物筛选，确定了改善CFTR通道门控特性的化合物类别（如ivacaftor），以及具有意外作用机制（mechanisms of action, MoAs）的化合物（如lumacaftor、tezacaftor和elexacaftor）。至于来那度胺的发现，科学家是受到沙利度胺能有效治疗麻风病、调节多种抗炎细胞因子、抑制血管生成并在多发性骨髓瘤中具有活性的启发，优化开发类似物来那度胺，最终被FDA批准用于多种血癌适应症的治疗并大获成功。值得注意的是，来那度胺新的分子靶点和MoAs在获批后几年才被阐明。

PDD策略扩大了“可药用”靶点的范围，包括一些令人意外的细胞过程（前mRNA剪接、靶蛋白折叠、运输、翻译和降解）、传统靶点新的MoAs（假激酶结构域抑制、变构激酶激活）和新型药物靶点（溴结构域）。因此，当调节疾病表型或相关通路的靶点未知、或旨在开发具有差异化MoA的一类新药时，应考虑PDD策略。

2.重新审视多重药理

多重药理（Polypharmacology）指一种化合物对多种靶蛋白具有活化或抑制作用，从而导致有多种药理作用。表型筛选提供了在多重药理中识别多靶点分子的机会[4]。传统上，在寻找更具选择性药物的过程中，由于难以厘清非靶点的所有生物功能，多重药理容易产生潜在副作用。然而，在治疗相关浓度下，大多数获批药物都已知与多个靶点相互作用，这些靶点通常是副作用的基础，但也可能有助于临床疗效。如伊马替尼既是BCR-ABL融合蛋白抑制剂，还表现出对c-KIT和PDGFR受体酪氨酸激酶的活性。 基于药物组合的多靶点方法是抗病毒、肿瘤、中枢神经系统（CNS）疾病和心脏病的公认策略，当只针对一个靶点时，可能会产生抗药性。一般来说，多靶点药物更适合于复杂的多基因疾病，这些疾病具有多种潜在机制。PDD方法提供了大量的药物和候选分子，通过MoA鉴定显示出靶向多重药理（如抗抑郁药丙咪嗪）。

3.发现低分子量化合物

随着TDD的出现，药物的分子量在过去几十年中显著增加[5]。而历史上如布洛芬、米诺地尔等小分子药物是通过表型方法发现的。小分子具有以下优点：尺寸小，更适合结合靶点，筛选时有效命中率更高；易于肠渗透，通过细胞旁空间起作用；对代谢酶的选择较少；给药安全。因此，可以利用动物模型表型筛选的方法，进入TDD难以覆盖的化学和药理学领域。例如近期发现的SEP-363856、MLR-1023和Lacosamide等药物（图2）。  

图2：表型筛选发现的低分子量临床候选药物 

 02   靶点识别、MoA分析方法和临床开发   

化合物进入临床前是否必须进行靶点鉴定一直是争议的焦点[6]。靶点识别通常被视为导致简单的“是”或“否”的二元结果（图3a），本文作者提出：靶点鉴定只是决定进入临床的方法之一，即使识别靶点并不意味完全了解MoA，反而会产生误导。比如：NS5A是HCV药物达克拉他韦靶标的文献，并没有合理解释其显著的亚纳摩尔细胞效力。因此，建议通过以下方法识别靶点和MoA：一是亲和力（或光亲和力）富集与蛋白质组学方法相结合，或者最近使用的细胞热位移分析，来识别与小分子结合的蛋白；二是借助RNAi、CRISPR-Cas9等遗传干扰法与化合物治疗相结合探索机制。 在没有确定靶点的情况下，临床开发是可行的，例如，来那度胺2005年被批准用于多发性骨髓瘤，而MoA在2014年被阐明；拉康酰胺2008年批准用于癫痫，其MoA仍在研究中；78132133和RG7834最近进入I期试验，但靶点识别工作尚未成功。出于安全考虑，可以获得更复杂的表型特征，并将化合物特异性图谱映射到斑马鱼或人类原发性细胞疾病系统（如BioMap）中，用临床批准药物指纹进行验证（图3b）。

图3：表型药物发现中的靶点识别 

 03   挑战与展望   

关于疾病的知识对于设计表型检测系统至关重要。目前，基因表达谱、细胞形态富集分析等数据已被用于定义疾病状态。2013年，Recursion Pharmaceuticals是第一个通过Cell Painting替代疾病特征的公司。如何更好地利用这些数据作为治疗效果的指标，是药物发现领域的下一个重大障碍。 人工智能在药物发现和开发的多个领域得到了广泛的应用。在药物发现方面的应用一类是将机器学习应用于大量化合物或化学结构，一类是将其应用于表型分析衍生特征。后者相关进展较少但潜力无限，例如Zoffmann等人将高通量成像、基因组学和机器学习的数据集结合起来，能有效地缩小、比对并预测化合物的MoAs；杨森公司研究人员将高通量成像（读取记录单个生物过程的少数形态特征）与机器学习相结合，证明了来自给定细胞的分析图像可以进行一系列生物的活动预测。 一项研究表明，制约研发生产率的主要因素是新的疾病相关模型的创建速度[7]。因此，继续发展具有确定临床转化能力的疾病检测方法，对未来PDD领域至关重要。目前，不同学科（干细胞生物学、功能基因组学、生物工程、仪器/数据分析等）和技术（模型组织的平台方法、高容量体内哺乳动物药理学、高保真Cas9、3D细胞培养等）的发展为开发潜在疾病检测系统提供了巨大的可能。在大数据时代，整合来自大量人群（例如英国Biobank和FinnGen）的真实世界患者记录及其组学数据，也有助于建立并验证模型系统。 

 04   结语   

当疾病病理的分子机制未知时，PDD策略提供了一条新的治疗途径，提供了触及未开发的“暗生物物质”的机会。当前的挑战是如何使PDD“工业化”（图4）。作者相信机器深度学习的应用，将整合基于靶点和表型的两种方法，有助于更高效的药物发现。

图4：工业化表型药物发现过程图

参考文献： [1] Swinney, D. C. & Anthony, J. How were new medicines discovered? Nat. Rev. Drug Discov. 10, 507–519 (2011). [2] Vincent, Fabien et al. Phenotypic drug discovery: recent successes, lessons learned and new directions.Nat Rev Drug Discov. 21(7):541 (2022). [3] Boyle, M. P. & De Boeck, K. A new era in the treatment of cystic fibrosis: correction of the underlying CFTR defect. Lancet Respir. Med. 1, 158–163 (2013). [4] Reddy, A. S. & Zhang, S. Polypharmacology: drug discovery for the future. Expert Rev. Clin. Pharmacol. 6, 41–47 (2013). [5] Shultz, M. D. Two decades under the influence of the rule of five and the changing properties of approved oral drugs. J. Med. Chem. 62, 1701–1714 (2019). [6] Moffat, J. G., Vincent, F., Lee, J. A., Eder, J. & Prunotto, M. Opportunities and challenges in phenotypic drug discovery: an industry perspective. Nat. Rev. Drug Discov. 16, 531–543 (2017). [7] Scannell, J. W. & Bosley, J. When quality beats quantity: decision theory, drug discovery, and the reproducibility crisis. PLoS ONE 11, e0147215 (2016).