Nature Reviews | 核酸的纳米材料递送系统、设计与应用

用于核酸传递的纳米材料具有很好的选择靶向性，是一种安全、高效、特异性和非致病性基因治疗材料。基因治疗和纳米传递系统结合，拓宽了这些分子的治疗和生物医学应用，如生物分析，基因沉默，蛋白替代和疫苗。

最近发表在Nature Reviews Methods Primers上的综述文章“Nanodelivery of nucleic acids概述了如何设计智能核酸递送方法，核酸传递纳米颗粒的一些设计考虑，它们的特性以及这些纳米材料与生物系统、病变细胞和组织的结构-功能关系。

作者 | Ting  

前言

基因治疗利用核酸作为功能分子，激活对多种疾病的生物治疗，如癌症、囊性纤维化、心脏病、糖尿病、血友病和艾滋病毒/艾滋病。

基因治疗主要可分为三大途径，详见图1。首先是使用CRISPR-Cas技术编辑突变基因，导致功能的获得或丧失。第二，通过插入DNA质粒(pDNA、mcDNA)、合成mRNA、环状RNA和自扩增RNA(saRNA)等分子来表达，可以实现基因表达的上调。最后，利用小干扰RNA(siRNA)、反义寡核苷酸(ASOs)、短发夹RNA(shRNA)和microRNA(miRNA)等分子下调基因表达。

  图1：三种基因治疗途径的示意图  

与传统药物相比，核酸的机制和高特异性具有很好的优势。基因传递策略通常分为病毒性和非病毒性。具有高DNA转染效率的病毒长期以来一直被用于治疗艾滋病毒、癌症和肌肉萎缩症等疾病，但其会被快速清除，且可能的副作用使得设计基于脂质、聚合物、多肽和无机化合物的非病毒基因传递系统至关重要。

表1：过去十年全球批准的基因治疗时间表   

纳米递送系统简介

1.1脂质纳米颗粒

脂质纳米递送系统是应用最广泛的非病毒核酸载体，主要原因是由于其在生理液体中稳定的纳米结构，并与带负电荷的内吞体膜融合，允许有效的核酸递送(图2d)。脂质纳米输送系统通常包含其他脂质成分，如磷脂、胆固醇或聚乙二醇(PEG)（图2a、b）。这些系统用于评估治疗遗传疾病（如囊性纤维化和丙酸血症）和实体肿瘤（图3）。

图2：用于基因传递的主要纳米颗粒设计方案  

脂质体由具有极性头基团和非极性尾部的磷脂以及稳定剂（如胆固醇）组成，由于其两亲性，它们会自发地自组装成囊泡。脂质体的制备方法有三种：膜水化、溶剂注射和反相蒸发，用于实现有效的药物包封、窄粒径分散和长期稳定性。

脂质纳米颗粒（LNPs）通常包括可电离和阳离子脂质、胆固醇、磷脂和聚乙二醇脂质(图2a)。LNPs在粒子核心内具有胶束结构（图3），比脂质体具有更好的动力学稳定性和更刚性的形态。生成LNP-核酸的方法包括洗涤剂透析和乙醇装载技术，基于快速混合技术的微流控混合方法和交错人字形混合方法。

图3：核酸负载LNP颗粒在癌症治疗中的工作流程

1.2聚合物纳米颗粒

聚合物纳米颗粒是使用天然聚合物生产的，即葡聚糖、壳聚糖和/或环糊精，或合成聚合物，如PLL、PEI、聚酰胺胺(PAMAM)和/或聚（乳酸共乙醇酸）(PLGA)(图2a)，允许具有不同组成和结构的聚合物纳米颗粒。

1.3无机纳米颗粒

无机纳米颗粒已被研究用于核酸传递和成像，包括金纳米颗粒、二氧化硅纳米颗粒和氧化铁纳米颗粒(图2d)。

1.4提高稳定性的方法

除了将核酸封装在纳米载体中外，核苷酸的化学修饰（包括主链、碱基和糖的修饰）还可以提高化学稳定性，降低核酸的免疫效应。

表2：核酸转运常用纳米载体的合成与功能化方法及其在临床试验中的应用    

结果

2.1纳米材料表征

①纳米材料的组成和合成：由于生物相互作用受到纳米材料组成的强烈影响，因此详细描述其成分，合成方案和纯化方式非常重要。

形态和大小分散性：纳米材料的大小和形状可以决定参与纳米材料内化的特定细胞途径(图4a)。

② Zeta潜力：纳米材料的表面电荷不仅影响细胞的响应，还影响生物分子在颗粒表面的吸附和纳米颗粒的生物分布(图4a)。

③药物的捕获和释放:如果纳米材料已被开发为携带一个分子，则可以被捕获的分子的数量应计算并报告为分子/粒子的浓度或质量百分比(图4a)。

④靶向定位:纳米材料可以被设计为靶向特定细胞或组织的系统，这依赖于纳米材料的物理化学性质来实现。

图4：常用核酸递送系统表征方法概述

2.2生物学特性

①体外研究。在转向细胞研究之前，首先研究纳米颗粒在受刺激的生物液体（如胎牛血清）中的稳定性，以了解生理条件下的纳米颗粒的识别界面(图4b)。体外研究应根据纳米颗粒的类型和组成、核酸类别和靶标疾病选择足够的细胞模型，来确定纳米颗粒药物效率和细胞毒性(图4b)。通过透射电镜、共聚焦显微镜和/或分析流式细胞镜可以研究负载核酸纳米颗粒的细胞摄取，这是确定纳米颗粒是否被细胞吸收的方法。

②临床前体内模型。纳米医学界一直在讨论个性化治疗的重要性，因此，动物模型的选择需要反映生物学场景。且由于纳米颗粒系统对核酸负载纳米颗粒的药代动力学、体内生物分布和整体治疗效果的影响，需要正确选择纳米颗粒的类型和传递纳米颗粒系统的给药途径。到达目标部位的纳米颗粒的数量对于评估所研究的纳米药物的疗效至关重要，因此需要报告每克组织的注射剂量的百分比和所测量的器官重量的数据。(图4c)。

应用

3.1生物分析

核酸-纳米颗粒偶联物在各种分析物的超灵敏检测中得到了广泛的应用，如核酸、蛋白质、小分子和金属离子（图5）。

图5：用于诊断应用的基于纳米粒子的核酸平台  

3.2基因沉默

通过纳米颗粒系统传递ASOs或RNAi已被探索用于许多适应症的治疗，如癌症和心血管、神经、感染和遗传疾病(图6a)。

3.3基因编辑

现代的基因编辑工具依赖于锌指核酸酶、转录激活因子样效应核酸酶和CRISPR-Cas9，允许在特定位点对DNA进行永久修饰。纳米颗粒被探索直接传递这些核酸酶蛋白用于基因编辑(图6b)。

3.4蛋白质替代

蛋白质替代疗法可以纠正导致疾病的功能障碍，蛋白质编码mRNA的传递是最有前途的方法之一。在血友病、肝和肺纤维化以及代谢性疾病的临床前模型中，利用LNPs系统传递mRNA作为蛋白质替代治疗(图6c)。

3.5疫苗和免疫治疗

最近FDA批准使用两种依赖LNPs传递平台的mRNA疫苗来抗击COVID-19大流行。而且聚合物纳米颗粒和一些无机纳米颗粒也被用于传递可供疫苗接种的核酸(图6c)。此外，核酸纳米颗粒的传递也被探索用于免疫肿瘤学。

3.6核酸纳米条码

合理设计的DNA序列可以被标记为特定的纳米颗粒作为DNA条形码，通过深度测序评估其体内生物分布，允许数百种化学性质不同的纳米颗粒配方作为一个给药池，并在单个动物中同时筛选(图6d)。

图6：用于治疗应用的基于纳米粒子的核酸递送系统

再现性和数据沉积

纳米颗粒在体内的命运和行为较为复杂，阻碍了它们的数据再现性，从而阻碍了它们成功的临床转化(图7a)。大规模存储库的发展受到纳米技术领域的跨学科限制，从医学到化学程序和术语，以及可能具有多种含义的缩写和缩略词的使用(图7b)。通过已定义的术语和结构化数据支持文本挖掘，自动处理检索相关信息，机器学习将能够模拟最佳拟合的纳米颗粒特征，以获得特定的生物行为(图7c)。

图7：基于核酸的纳米颗粒临床转化的主要局限性和解决其局限性的潜在策略  

限制和优化

非病毒载体的物理化学性质极其重要，冻干方法已经被探索来提高纳米颗粒的储存和运输的稳定性。纳米医学研究报告缺乏标准化，危及了不同纳米材料的比较和工程设计方法的评估，进而危及了与其他研究的比较，对生物-纳米界面的基本理解和成功转化为临床。研究界对提高数据透明度和可重复性的联合努力被认为对克服一些限制至关重要，这为开发针对治疗选择有限的罕见疾病或疾病的精确基因治疗带来了希望(图7d)。

前景与挑战

①超越肝脏。可以对更高效的聚合物成分进行修饰，以减少非特异性蛋白的吸附，抑制蛋白冠的形成。

②实验数据缺乏标准化和可重复性。为了确保临床结果的准确性，核酸纳米载体的同质性至关重要，需要改进生产，纯化和表征方法。

③利用基因纳米颗粒递送作为一种更容易获得和更负担得起的临床策略。需要鼓励新的参与者进入核酸领域，开发需要长期开发时间和大量资源的新输送技术。

④针对个性化医疗的人工智能和机器学习。机器学习算法的进一步发展可为克服现有的挑战和知识差距提供必要工具。

参考文献：   [1] Mendes, B.B., Conniot, J., Avital, A. et al. Nanodelivery of nucleic acids. Nat Rev Methods Primers 2, 24 (2022). https://doi.org/10.1038/s43586-022-00104-y