DNA编码化合物库：万物皆可筛

前言  

在细胞分子生物学中，生物大分子与小分子的相互作用贯穿着基因表达、蛋白质执行功能的过程。其中，鉴定与识别小分子-蛋白质的相互作用能够帮助人们了解疾病的发生与发展，正确引导药物研发的方向。1990年代以来，高通量筛选（High throughput screening，HTS）成为小分子药物研发的主流平台。结合组合化学原理构建的化合物库与高通量、自动化仪器，可针对靶标进行高效、快速的筛选过程，加快新药研发进程。然而，传统的高通量筛选存在一定的局限性，例如：成本高、耗时、化学空间小、靶标覆盖范围有限等。

1992年，美国Scripps研究院的Sydney Brenner和Richard Lerner首次提出在磁珠上构建DNA编码化合物库（DNA-Encoded Chemical Library, DEL ）的概念。概念中的DEL是通过固相合成的方式构建多肽化合物库，即一珠一化合物库（one bead one compound library，OBOC Library）。经历数十年的发展，结合DNA兼容反应的开发、下一代测序技术的发展，DEL技术成为了当前药物研发的新兴技术平台。现代的DNA编码化合物库通常在液相中构建，主要流程为将预先设计好的寡聚核苷酸序列作为标签，对化学分子基元进行编码，利用组合化学的原理进行DNA编码化合物库的构建。人们可以利用DNA编码化合物库，针对微量的疾病靶标进行基于亲和力的筛选，真正实现高通量、快速、高效的小分子-蛋白质相互作用鉴定与识别。完成筛选流程后，DNA条形码发挥其编码的功能，通过测序技术可对得到的化合物信息进行解码。

本篇文章的通讯作者是来自香港大学的李笑宇教授与重庆大学的李亦舟教授，李笑宇教授课题组主要致力于DNA编码化合物库筛选策略的开发、活性分子靶点识别与分子机制的研究并取得多项原创性工作，李亦舟教授课题组主要致力于DNA编码化合物库的新药先导化合物研究、以核酸为主的化学生物学研究，并在高水平期刊发表了多项工作。

DNA编码化合物库的筛选策略基本流程是将DNA编码化合物库与靶标进行孵育后，基于小分子-蛋白质的亲和结合作用力，经过不同的洗脱方式，除去非结合小分子，实现具有高亲和力的小分子配体的高倍富集，结合PCR扩增与下一代测序的技术，可根据小分子的DNA标签实现化合物信息的解码（图1a）。

DNA编码化合物库筛选的基本要点：

1.根据DEL筛选的基本流程，我们可以得知，DEL理论上可实现任何可以被纯化或者固载的蛋白质，其中也包括目前尚未报道已知配体或者未知三维结构的蛋白质靶标。基于这一优势，DEL技术平台被广泛应用于药物研发领域中。

2.DEL筛选大多是根据小分子-蛋白质之间的结合亲和力实现筛选的，筛选过程需要同时考虑热力学平衡常数与动力学解离常数。因此筛选过程中诸多因素（DNA拷贝数、洗脱条件、温度等）将对筛选结果产生影响，由此定量PCR也常被用于对筛选进行质量控制，以确定DNA的拷贝数，对化合物的规模进行评估，辅助研究人员优化筛选条件。

3.固相筛选的两大局限性：①蛋白质的固载方式可能改变蛋白质生理响应过程，配体化合物不与蛋白质活性口袋结合，进而影响DEL筛选的真实性，往往需要再次对Hit化合物进行再次验证。②重要的药物靶点难以实现纯化、固载；固载后的靶标蛋白可能会完全失活。因此，DEL可用的靶标蛋白受限。针对以上两点局限性，研究人员将目光转向开发液相筛选策略（图1b，c），再次展现了DEL筛选的应用潜力。后文将详述。

4.在复杂的生理环境中实现DEL筛选策略是未来的发展趋势，能够为药物研发提供更具潜力的候选化合物。

图1 DEL筛选的通用流程以及实现功能化DEL筛选的关键因素

接下来，我们将根据综述内容归纳DEL筛选策略的发展    

一、亲和筛选   

1.早期DNA编码化合物的筛选策略：固相筛选  

早期DNA编码化合物库是在固相载体中构建的，即OBOC-DELs，主要针对可溶性靶点进行筛选。筛选的基本流程如下：研究人员将待筛选的靶蛋白预先固载，随后将固载的蛋白质与DEL孵育，能够与靶蛋白基于亲和力结合的配体小分子-DNA耦合物可由液相转移至固相中，随后通过洗脱过程，实现高亲和力小分子的富集。这种基于固载靶蛋白的筛选策略为固相筛选（图1b）。如前文所述，为突破固相筛选的局限性，研究人员开发了不同的DEL液相筛选策略，旨在进一步丰富DEL筛选的靶标范围；提高DEL筛选的效率。

2.液相筛选策略（目前已报道的液相筛选策略主要有以下几种类型以及实例）   

2.1基于配体化合物-蛋白质相互作用实现DEL筛选  

哈佛大学David Liu课题组针对细胞裂解液开发了一种相互作用的测定策略（IDUP），该策略只有可结合的小分子才能形成可PCR扩增的配体-蛋白复合物（图2a，上）。Vipergen开发了一种结合-陷阱-富集（binder trap enrichment, BTE）筛选策略，该策略基于乳液体系将DEL成员包封在液滴中，通过对液滴分选实现配体-蛋白质复合物的分离、鉴定（图2a，下），BTE体系在随后的优化中，也被应用到了活细胞筛选中（图4b）。

2.2基于配体化合物-蛋白质之间的共价交联实现DEL筛选    

香港大学李笑宇课题组于2013年报道了DNA编码亲和标记体系（DNA-programmed photoaffinity labeling, DPAL）。该体系由两种不同功能的互补DNA单链发挥作用，分别为带有光交联基团的DNA为捕获DNA探针，带有已知配体小分子的DNA为结合DNA探针。通过结合DNA探针拉近捕获DNA探针与靶蛋白的距离，经光照后实现DNA对靶蛋白的标记。李笑宇课题组基于DPAL体系开发了相应的液相筛选策略（图2b，左），对策略优化后，更是实现了针对活细胞膜蛋白的DEL筛选（图3e），进一步突破了DEL筛选中靶蛋白种类的局限性。

普渡大学Krusemark课题组也曾报道相似的液相筛选策略，该策略的关键在于双链DNA前端延伸出一段用于与光交联结合DNA探针杂交的单链DNA（图2b，右），该策略拓展了该类型筛选策略的建库场景，适用于双链DEL。

2.3基于配体-蛋白质相互作用的动力学平衡实现仪器辅助的DEL筛选  

约克大学Krylov课题组利用动力学毛细管电泳（kinetic capillaryelectrophoresis，KCE），实现仪器辅助的DEL筛选。目前该策略仅在模型体系中验证，尚未应用于真实筛选中。

2.4 DNA编码动态化合物库（DNA-encoded dynamiclibrary，DEDL）的筛选策略  

瑞士苏黎世理工学院Neri课题组报道了双药效团的编码自组装化合物库（encodedself-assembling chemical library，ESAC library），后续陆续有不同的课题组报道开发了不同类型的DEDL，在DEDL筛选中，靶蛋白与配体化合物对相互结合，促进DNA双链的形成，随后进行DNA-蛋白质复合物的分离、富集。

图2 液相筛选策略

小结  

目前所报道的筛选策略开发的关键在于通过不同的交联方式保留、捕获配体化合物-蛋白质相互作用，其中DNA-蛋白质共价交联复合物发挥了重要作用。或许，人们可以深入思考如何利用不同方式构建DNA-蛋白质耦合物以实现捕获配体-蛋白质不同程度的相互作用。

3.复杂的生物靶标  

在液相筛选的基础上，研究人员将DEL筛选的应用场景拓展到更复杂的生理环境中，而策略的开发关键在于如何提高靶标特异性。

3.1细胞裂解液  

细胞裂解液中进行DEL筛选，可通过靶蛋白的过表达提高靶蛋白的特异性，参考David Liu的IDUP策略（图3a）。

3.2膜蛋白    

在药物研发领域中，膜蛋白与疾病的发生密切相关。但由于膜蛋白的尺寸、疏水性、生理活性依赖细胞膜上的磷脂双分子层，其配体化合物的发现一直困扰着研究人员。在理想的情况下，对膜蛋白的筛选最好是在活细胞中进行（图3b）。

在DEL筛选策略开发中，膜蛋白在细胞膜丰度低的问题可通过过表达的方式解决。

GSK公司于2015年首次报道在HEK293细胞上针对过表达的NK3速激肽受体进行筛选。该策略将过表达NK3受体的细胞离心浓缩至约 107 个细胞/mL 的悬液，提高NK3的有效浓度（图3c）。

2019年，Krusemark 课题组将其共价交联液相筛选的策略（图2b，右）应用于活细胞的筛选中，该案例是在HEK293T细胞上过表达与SNAP标签融合的A片类受体，在完成孵育、筛选后，将细胞裂解，利用SNAP标签将配体化合物-靶蛋白复合物纯化，完成后续的鉴定（图3d）。

图3 在细胞裂解液与活细胞表面进行DELs筛选   

3.3活细胞内筛选  

在细胞质内进行DEL筛选首要难题是如何将DEL members递送至细胞内。2019年，Krusemark 课题组首次报道了活细胞内的DEL筛选，该策略的关键在于将细胞穿透肽（cell-penetrating cyclicpeptide， cCPP）结合到DNA标签的末端，辅助DEL member穿透细胞（图4a）。2021年，Vipergen 通过显微注射的方式向爪哇蟾卵母细胞注射DEL，利用BTE策略实现了活细胞内的DEL筛选（图4b）。

图4 在活细胞中实现DELs筛选

3.4核酸  

理论上DNA或者RNA也可以作为DEL筛选的靶点，但是目前仅有一篇关于G-四联体的DEL筛选的报道。靶向DNA或者RNA的关键在DNA标签不能与靶标出现互补折叠，由此，双链DEL可能更适用于该类靶标的筛选中。除此以外，实验条件（例如，离子强度）也会影响DNA标签与靶标之间的相互作用。因此，以核酸做靶标进行DEL筛选的策略仍有待开发。

小结  

根据现有报道，除了纯蛋白作为筛选靶标，DEL筛选还可应用于细胞裂解液、活细胞以及核酸的配体筛选中。这些策略的开发丰富了DEL筛选的靶标范围，突出了DEL筛选的优势。

二、功能性筛选  

如前文所述，基于亲和筛选已开发了多样的DEL筛选策略。但对于DEL而言，基于亲和筛选的前期研究经验，开发将DNA标签的读出与小分子活性信息结合的筛选策略才是未来的发展方向之一。

图5 功能性DEL筛选策略  

1.针对功能活性位点进行直接筛选

1.小分子结合到靶标上的特定活性位点发挥生理功能，可能会产生抑制或者激活的作用。而常规的DEL筛选是不具备位点特异性的，而是通过已知配体化合物的信息提供位点信息（图5a）。例如，X-Chem报道了针对BTK蛋白进行DEL筛选，利用有/无ATP的DEL筛选的结果对比，通过已知配体提供活性位点结合的信息，得到BTK蛋白的新活性口袋信息。

2.共价抑制剂与靶蛋白的共价结合机制能够辅助功能性DEL筛选（图5b）。然而，这需要共价Warhead化合物库的构建以及需要更严格的洗涤条件。

2.调控靶点的结构  

当活性配体与靶蛋白结合时，蛋白质的结构可被稳定在活性或者非活性的状态（图5c）。基于这一性质，X-Chem报道了在DEL筛选过程加入已知的正构拮抗剂，通过调控靶点的构象，筛选鉴定了新的别构拮抗剂。但这一策略受限于蛋白质的性质以及需要可获得的已知配体。

3.利用DNA标签编码生化反应结果

基于生物活性的DEL筛选应仅扩增活性化合物的DNA标签，而非代表所有结合小分子信息的DNA标签。实现这一目标，则需要充分利用蛋白质介导的生化反应对化合物结构变化产生的影响。例如，瑞士日内瓦大学Winssinger课题组报道了针对蛋白酶的底物化合物库的筛选策略。每个库成员带有预先淬灭的荧光基团与PNA编码的多肽。与靶蛋白孵育过程中，多肽底物经蛋白切割，可产生荧光信号turn-on，随后由微阵列分析读出结构信息（图5d）。与此类似，也可利用酶的磷酸化活性使库成员磷酸化，随后利用抗体进行检测（图5e）;也可利用含有生物正交基团的衍生物试剂，对有活性的分子库成员进行修饰，随后实现生物素的标记，进行富集筛选（图5f）。这些策略中的DNA标签依然编码化合物的结构信息，但通过特殊的筛选策略设计，能将活性筛选的指标转化为某种形式的亲和富集的指标。因此，能够筛选获得活性化合物。

4.OBOC-DELs  

现代OBOC-DELs结合自动化仪器与光可断裂的连接子，可实现OBOC-DEL成员在液滴中进行小分子-off DNA的活性分析。这种类型的策略通过微流控系统将OBOC-DEL每个成员与靶标及其他成分进行液滴包封，在光照条件下释放小分子，利用流式细胞仪进行信号读出，进而完成DEL筛选（图6a）。美国Scripps研究所Kodadek课题组与paegel课题组的系列工作推动了OBOC-DELs的优化发展（图6a,6b），后续也有报道分析了OBOC-DELs应用于表型筛选的可能性（图6c）。

图6 OBOC-DELs使新型功能性DEL筛选成为可能  

总结

目前，DEL筛选在复杂靶标、功能性筛选的策略突破再次刷新了人们对于DEL技术的看法。