文献精读 | 皮质第五层锥体神经元：全麻的潜在靶点

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背  景

BACKGROUND

    意识的形成依赖于大脑皮质活动。大脑皮质分为六层（layer，L)，每层均由不同神经细胞组成。在小鼠的感觉皮层微环路中，外界信息由下丘脑传入皮质第四层（L4），经过第二、三层（L2/3）最终到达第五、六（L5、6）层传出。每一层的兴奋性神经元均接受其他兴奋性神经元和抑制性神经元的输入。L1由胞体位于L2/3-L6的兴奋性神经元树突、长轴突和抑制性神经元组成。L5兴奋性锥体神经元（pyramidal neurons, PNs）根据输出类型分为三种：长程投射至其他皮质区域的intratelencephalic（IT）神经元；投射至下丘脑等皮质下区域的pyramidal tract（PT)神经元，以及和与同层内其他锥体神经元连接的near-projecting神经元。

    临床上常见的麻醉药包括异氟烷（Isoflurane，Iso）、芬太尼-美托咪定-咪达唑仑（Fentanyl-Medetomidine-Midazolam， FMM）和氯胺酮-甲苯噻嗪（Ketamine-Xylazine ，Ket-Xyl）。这些药物介导麻醉的分子机制不尽相同，却均能诱导意识丧失，引起相同的脑电活动变化。研究发现不同种类的全麻药可在某些皮层内具有相同的作用。脑电图 (EEG)、脑皮层电图（ECoG）显示在全麻状态下，L5和L6层的长投射锥体神经元活动发生改变。多电极记录显示L5和L6皮层在全麻状态下平均局部活动低频功率增加，L5 神经元对外部刺激和人为诱导的顶端树突刺激的应答减少。

    目前人们对全麻下不同神经元的电活动变化还知之甚少。尽管对单个神经元或神经元群的电信号记录显示全身麻醉对皮质具有影响，但目前脑电记录方式却难以准确定位这些神经元的位置，且缺乏细胞类型特异性。因此，跨皮层检测同种类型神经元的活动能够更好地解动物行为与神经元电活动变化的时空相关性提供参考。在本研究中作者通过发现了全身麻醉药持续影响小鼠L5椎体神经元自发电活动但不影响其他细胞类型电活动的机制。

结 果

RESULTS

不同种类全麻药均可引起L5 PNs同步化

    为探究全麻药物对特定类型皮质细胞（L5锥体神经元）的影响，作者将AAV-CAG-FLEX-GCaMP7s转染至Rbp4-Cre KL100转基因小鼠皮质中通过在体双光子钙成像观察L5锥体神经元活动。在FMM、Iso和Ket-Xyl三类全麻方案下小鼠EEG的θ波（3.5-10Hz）和δ波（0.5-3Hz）功率之比均下降。不论在清醒状态还是麻醉状态，L5 锥体神经元均表现出自发的钙活动。作者计算了每个神经元的活动和其余所有神经元的平均活动之间的关系，并将其定义为“神经元同步化”。与清醒时相比，麻醉状态下L5神经元钙活动的同步性显著提高，平均放电频率和振幅也发生变化（图1）。然而三种麻醉处理引起的变化不大一致（图2）。

▲ 图 1

▲ 图 2

L5 PNs同步化与意识状态有高度相关性

    为研究麻醉诱导下L5锥体神经元同步化增高与意识丧失之间的关系。作者将小鼠暴露于异氟醚，以3秒的间隔检测了神经元同步化的“瞬时”分布，并与完全清醒和完全麻醉状态下的同步化程度进行对比，获得了两条曲线，用于描述瞬时神经元同步性在清醒状态（“清醒概率曲线”）或麻醉状态（“麻醉概率曲线”）中变化的概率。结果表明在Iso 麻醉开始后，清醒概率曲线下降，麻醉概率曲线上升。在82.5 ± 7.5 s，曲线交叉，作者将该时间点定义为从清醒到麻醉状态下神经元同步化的转变时间。接下来作者将神经元活动同步程度与小鼠行为（眼睛转动、胡须抖动和身体运动）进行了关联分析。结果显示麻醉诱导下，神经元同步性的转变时间与运动行为的转变时间无显著差异，表明神经元同步性的转化与小鼠运动行为的转化具有高度相关性。接下来作者以 15 秒的间隔测量了瞬时θ-δ EEG 比率，类似的计算方式作者得到清醒和麻醉概率曲线在 Iso 开始后的 76.5 ± 7.5 s 处交叉，并将该时间点定义为从清醒到麻醉状态下脑电图谱功率的转变时间。上述结果表明Iso麻醉下，神经元同步的转变时间与脑电图谱功率的过渡时间密切匹配，均处于运动行为的过渡时期（图3）。

▲ 图 3

神经元同步化仅发生在L5 PNs

    那么以上神经元同步性的增强是否也发生在其他类型的神经元中？作者对初级视觉皮层L1，L2/3，L4，L的神经元同步性进行了分析，结果发现在初级视觉皮层其他层内，无论是锥体神经元还是中间神经元，三种全麻方案下神经元的同步性均不一致。这说明麻醉引起的神经元同步性增强是L5锥体神经元特异性的（图4）。

▲ 图 4

全麻状态下投射至L5的突触前神经元活动被抑制

    为了进一步研究全麻状态下L5 锥体神经元同步化的机制，作者对L5神经元的输入进行了研究。L5 锥体神经元的输入大多来自于同层的其他神经元，少部分来自于其他层。作者采用PHP.eB AAV-syn-FLEX-splitTVA-EGFP-tTA，PHP.eB AAV-TREtight-mTagBFP2-B19G和EnvA-SADDG-GCaMP7s rabies virus联用的双AAV策略实现单突触逆行跨突触的标记，感染后7天可观察到L5外的突触前神经元成功表达GCaMP7s。通过对清醒和麻醉状态下神经元电活动记录发现，这些突触前神经元在清醒时活跃，但Iso麻醉状态下活动显著降低（图5）。

▲ 图 5

L5 PNs在全皮质区域广泛同步化

    为进一步了解L5 锥体神经元同步化是否在全皮质的发生情况（前文仅探究了视皮质），作者在Rbp4-Cre小鼠皮质中注射AAV-CAG-FLEX-GCaMP7s，对皮层进行了广域的荧光成像，记录清醒和麻醉下的钙活动变化。结果显示三种全麻方案均能诱导不同区域的L5锥体神经元同步性增高（图6）。

▲ 图 6

L5 PNs底部树突与胞体同步化

    L5 锥体神经元顶端树突延申至皮质表面并在L1内形成顶簇，底部树突则位于L5内。为了探究全麻条件下L5锥体神经元顶簇和底部树突的自发性活动是否也会发生同步化，作者采用在体双光子钙成像的方式对视皮层L5锥体神经元的顶簇和底部树突的活动进行检测。结果显示三种麻醉处理均能诱导顶簇之间和底部树突之间活动高度同步化。作者接下来想要探究顶簇之间和底部树突之间的活动同步化是否与胞体活动相关，通过成对膜电钳同时记录了位于L5的胞体和顶簇/底部树突的活动。结果显示，在FMM全麻条件下，L5 锥体神经元的底部树突同步化与胞体同步化行为具有一致性（图7）。

▲ 图 7

L5 PNs输出同步化

    如背景中所述，L5锥体神经元根据输出类型可分为IT神经元、PT神经元和near-projecting神经元。为了探究这些被投射的区域是否接受来自于L5锥体神经元的同步活动，作者记录了L5视皮层IT和PT锥体神经元亚群的输出活动。结果显示与清醒时相比，三种全麻条件均能诱导IT和PT神经元输出高度同步化。因此，在麻醉期间，L5 PN将局部皮质区域的同步化输出至皮质下区域和远处皮质区域（图8）。

▲ 图 8

总  结

CONCLUSION

    本文揭示了小鼠皮质第五层锥体神经元电活动与麻醉的关系，发现了不同麻醉药物均能引起L5 锥体神经元同步性增强。在进入麻醉状态和从麻醉状态中复苏的过程中，L5锥体神经元的变化与意识的丧失和恢复相一致，这种神经元高度同步化在全皮质内大范围存在，且仅在L5 锥体神经元中出现。研究者推测这可能是不同种类全麻药物引起意识丧失的共同靶点和机制。

原始文献：

Bharioke A, Munz M, Brignall A, Kosche G, Eizinger MF, Ledergerber N, et al. General anesthesia globally synchronizes activity selectively in layer 5 cortical pyramidal neurons. Neuron 2022; 110(12): 2024-2040 e2010.

编   译：梁昕悦

排   版：蒋    明

校   审：方    芳

              缪长虹