科研丨Nature子刊: 慢阻肺疾病气道宿主-微生物相互作用的多组学分析确定了潜在的治疗干预措施(国人佳作)

编译：微科盟微知道，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读   

气道微生物组在慢性阻塞性肺疾病(COPD)中的作用机制在很大程度上仍未被探索。本研究通过对我国99名COPD患者和36名健康个体的痰液宏基因组、代谢组、宿主转录组和蛋白质组进行深入分析，展示了COPD中气道微生物组-宿主相互作用的概况。

通过序列中介效应分析整合多组学数据，以评估微生物组与两种主要COPD炎症内型(嗜中性粒细胞或嗜酸性粒细胞炎症)的相关性。

利用微生物遗传信息和建立的代谢物-人类基因对确定了“微生物组-代谢物-宿主”相互作用的假设。中性粒细胞为主的COPD的一个重要假设是气道乳杆菌中色氨酸代谢的改变与吲哚-3-乙酸(IAA)的减少相关，这反过来又与受干扰的宿主白细胞介素-22(IL-22)信号传导和上皮细胞凋亡途径有关。

体内和体外研究表明，气道微生物衍生的IAA通过IL-22介导的巨噬细胞-上皮细胞相互作用减轻中性粒细胞炎症、细胞凋亡、肺气肿和肺功能下降。鼻内接种两种气道乳杆菌可恢复IAA并重现其对小鼠的保护作用。这些研究结果为靶向COPD中微生物-宿主相互作用的治疗手段提供了理论依据。    

论文ID

原名：Multi-omics analyses of airway host–microbe interactions in chronic obstructive pulmonary disease identify potential therapeutic interventions

译名：慢性阻塞性肺疾病气道宿主-微生物相互作用的多组学分析确定了潜在的治疗干预措施

期刊：Nature Microbiology

IF：30.964

发表时间：2022.8.22

通讯作者：王璋，周宏伟，陈荣昌

通讯作者单位：华南师范大学生态科学研究所；南方医科大学珠江医院；深圳市人民医院呼吸疾病研究所

DOI号：10.1038/s41564-022-01196-8

实验设计

结果

COPD痰液宏基因组 

本研究收集了广州与深圳两地共99例慢阻肺患者和36例健康对照的诱导痰进行多组学分析(补充数据图1)。宏基因组测序平均每个样本产生1.83×108个高质量reads(补充表1)。去除宿主reads后，平均保留1.53×107个微生物reads(保留reads的比例:1.8-71.8%)，从组装的重叠群中产生2,901,665个非冗余微生物基因。

其中，1,722,043个基因(59.3%)被注释到6678个KOs。随着样本量的增加，基因和KO水平的稀疏曲线都接近平台期，表明有足够的宏基因组覆盖(补充图1a)。在发现和验证数据集中，COPD患者与分类和功能特征对照之间存在部分但显著的差异(图1a)。位点与所有个体以及COPD患者和对照组的分类学和功能特征相关(分类学：R2=0.038，P=0.017；宏基因组：R2=0.047，P=0.017)(补充图2)。

来自基于reads的分类学中的31个物种在COPD和对照组之间差异丰富(错误发现率(FDR)<0.1)。Moraxella catarrhalis和Pseudomonas aeruginosa的相对丰度在COPD中增加最多，而Prevotella intermedia在COPD中减少最多(图1b和补充表2)。在这31个物种中，有20个与COPD在两个部位具有相同的方向性(补充表2)。qPCR结果显示COPD中细菌总量与对照组相比无明显下降(补充数据图2a)。

为了便于解释COPD相关的微生物功能，我们将KO水平的关联聚集到KEGG模块中，通过使用Wilcoxon秩和检验将每个模块中与COPD相关的所有KO水平与模块外(背景)其余KO的水平进行比较。在所有461个KEGG模块中，有113个与COPD相关(补充表3；FDR<0.05，图1C显示了44个FDR<0.01的模块)。除M00375和M00563外，其余113个模块的显著水平均大于随机排列(P<0.05，补充表3)。

对于这些模块，为每个样本计算代表模块富集程度的分数，从而产生维度降低的模块级宏基因组图谱(MetaG模块，图1c)。KEGG富集分析发现细菌转运系统和氨基酸生物合成模块在COPD患者中普遍富集，而减少的模块包括能量代谢和氨基酸代谢。

不同的模块组与痰中性粒细胞或嗜酸性粒细胞百分比相关，表明内型特异性宏基因组特征(补充数据图2b、补充表3和图1c)。没有分类群或功能模块与吸烟状况或吸入皮质类固醇(ICS)的使用显著相关(补充图3和补充表2和3)。为了在基因组水平上探索微生物组的变化，我们通过基于基因组特征的重叠群分箱来重建宏基因组物种(MGS)。

在总共产生的1,273个基因组分箱中(占所有重叠群序列的43.7%)，根据“MIMAG”标准(补充表4和补充图1B)，分别有384和82个符合中等和高质量标准，其中384个bins包括66个种及40属(图1D)，涵盖所有主要门，占总系统发育多样性(Faith’s系统发育多样性)的37.4%。COPD患者与对照组相比，MGS衍生物种的差异趋势与基于reads的分类法得出的差异趋势基本一致(补充数据图2c)。

总体而言，这些结果表明COPD患者的气道宏基因组发生了变化，其特点是氨基酸的合成代谢途径相对于分解代谢途径的比例增加。

图1 慢阻肺患者和健康对照组的气道宏基因组图谱。

a.主成分分析表明，COPD患者和健康对照组在分类学和功能特征方面存在部分但显著的分离，独立于发现(广州)或验证(深圳)数据集。用置换多元方差分析来确定显著性。

b.使用基于reads的分类法绘制COPD患者和健康对照之间31种差异丰富物种的箱线图。c.聚类热图显示COPD患者和健康对照组在发现(广州，GZ)和验证(深圳，SZ)数据集(FDR<0.01)中差异丰富的KEGG模块。

采用Ward方法对模块和样本进行双向层次聚类。模块的树状图没有显示。与肺活量(FEV1)和痰液差异细胞计数(NEU，中性粒细胞；EOS，嗜酸粒细胞；Mφ，巨噬细胞)的模块水平Spearman相关性，以及模块的功能类别显示在热图旁边。CckA，细胞周期组氨酸激酶A；ChpA，pil-chp组氨酸激酶A；ChpB，pil-chp组氨酸激酶B；CpdR，双组分受体蛋白CpdR；CtrA，细胞周期转录调节因子A；EHEC，肠出血性大肠杆菌；EPEC，肠致病性大肠杆菌；PleC，多效发育基因C；PleD，多效发育基因D；PTS，磷酸转移酶系统；RpaAB，双组分反应调节器RpaAB；SasA，聚球藻自适应传感器A；tRNA，转移核糖核酸。

d. Cladogram图显示COPD患者与对照组相比，384个MGS满足中等及以上质量，其完整性、污染和倍数变化。

COPD痰代谢组、宿主转录组和蛋白质组

非靶向痰代谢组学产生了1,671种已知的代谢物。在COPD患者和健康个体之间观察到了部分但显著的分离(图2a)。

通过加权相关网络分析(WGCNA，MetaB模块)，将所有代谢物分为128个共丰度模块。分别有37个和24个模块在COPD中显著富集或减少(前10个模块如图2b所示；补充表5，FDR<0.05)。37个COPD富集模块包含475种代谢物，其中35.6%是氨基酸、碳水化合物和类固醇。COPD中的氨基酸积累与其宏基因组中代谢的改变一致。

24个COPD减少的模块包括275种代谢物，其中89个是磷脂酰胆碱或磷脂酰乙醇胺(补充表5)，这一结果也与COPD宏基因组中磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺(P00564)的分解代谢增加相一致。

包含氨基酸、脂质和胆汁酸的61个模块中有38个与痰中性粒细胞相关，而16个模块主要包含与嗜酸性粒细胞相关的磷脂酰胆碱(FDR<0.1，补充数据图 3a和补充表5)。

对于宿主转录组，所有19,142个人类基因被分成497个共丰度模块(宿主转录组(HostT)模块)。

其中，126个模块在COPD患者和对照组之间差异表达，并且可以富集到经典途径(图2c所示的前十个模块；补充表6，FDR<0.05)。最高的差异模块与上皮细胞凋亡、气道平滑肌收缩、hedgehog信号传导和中性粒细胞细胞因子的产生有关。大多数差异模块(88.9%)与嗜中性粒细胞相关，而与嗜酸性粒细胞趋化性、嗜酸性粒细胞蛋白释放和肥大细胞迁移相关的14个模块(11.1%)与嗜酸性粒细胞相关(FDR<0.1，补充数据图3b)。卷积分析表明转录组差异是细胞组成差异和细胞内基因表达变化的结果(补充表6)。

宿主蛋白质组的分析确定了60种痰液和38种血清蛋白质(宿主蛋白质组(HostP))在COPD患者和对照组之间差异表达(仅发现数据集，图2d，补充数据图3c,d和补充表7，FDR<0.1)。虽然有个别模块与吸烟或ICS相关，但整体的代谢组和宿主多组学特征与吸烟或ICS没有明显关联(补充图3和补充表5-7)。

总的来说，共同改变的微生物组、代谢组和宿主活动表明COPD中微生物-宿主的相互作用受到干扰。降维得到了113个Metagome(MetaG)、61个代谢组(Metab)、126个HostT模块和98个HostP特征与COPD相关，确保了有足够的统计能力进行综合分析。

对于每种类型的组学数据，都有一组病情较轻的COPD患者与健康对照组相比显示出有限的差异(补充表8)，这表明COPD的多组学变化特别是由疾病严重程度增加的患者驱动的。

图2 慢阻肺患者和健康对照的气道代谢组、宿主转录组和蛋白质组谱。

a.主成分分析表明，COPD患者和健康对照组的代谢组、宿主转录组以及痰和血清蛋白质组之间存在部分但显著的分离。

痰和血清蛋白质组只针对发现数据集中的一部分个体进行了表征。b.痰代谢组的共丰度模块。

为便于展示，显示了COPD患者和健康对照组之间的前十个差异模块。代谢物与肺活量(FEV1)和痰液差异细胞数(NEU、EOS、Mφ)的关联，以及代谢物的功能类别显示在热图旁边。c.宿主转录组的共丰度模块。只显示了COPD患者和健康对照之间的前十个差异模块。

基因水平与肺活量(FEV1)和痰液差异细胞数(NEU、EOS、Mφ)的关联，以及该基因在富集程度最高的通路中是否存在，都显示在热图旁边。d. COPD患者与健康对照组痰蛋白和血清蛋白的差异。AXL，AXL受体酪氨酸激酶；BCMA，肿瘤坏死因子受体超家族成员17；FGF-19，成纤维细胞生长因子19；GRO，生长调节α蛋白；HGF，肝细胞生长因子；ICAM-3，细胞间黏附分子3；LIF，白血病抑制因子；MCP-3，单核细胞趋化蛋白3；MDC，巨噬细胞衍生趋化因子；sRAGE，可溶性晚期糖基化终末产物受体；Tie-2，酪氨酸蛋白激酶受体TIE-2；VEGFR1，血管内皮生长因子受体1。 

COPD微生物-宿主相互作用的综合多组学研究 

本研究假设气道菌群产生或消耗的代谢物影响人类基因表达，这与嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞COPD存在差异。

为了验证这一假设，我们沿着“微生物组-代谢物-宿主”轴的多组学模块进行了中介分析，以评估微生物组(MetaG)依次通过代谢组(MetaB)、宿主转录组(HostT)和蛋白质组(HostP)对宿主表型(嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞炎症)的影响(图3和补充图4)。

对于中性粒细胞和嗜酸性粒细胞COPD，72.7%和39.5%的配对交叉组学链接分别存在显著的中介效应(FDR<0.05，补充数据图4a)。与嗜酸性粒细胞百分比相比，痰中性粒细胞的多组学中介效应更强(P<0.001，补充数据图4b)，这意味着中性粒细胞COPD中的微生物-宿主关联更为强烈。为了促进相关模块的功能解释，我们采用了一种自动化方案，该方案根据现有数据库的证据识别模块对之间的生物学联系(图3)。

如果MetaG中的基因编码催化MetaB中代谢物反应的酶，我们认为两个MetaG和MetaB模块在生物学上有联系。

同样，如果MetaB中的代谢物与HostT中的人类基因有已知的相互作用，则两个MetaB和HostT模块也有联系。

如果编码蛋白质的基因存在于HostT或其最丰富的途径中，则HostT模块进一步与痰或血清蛋白相关联。

总体而言，与嗜中性和嗜酸性COPD相关的MetaG-MetaB-HostT链接分别有620个和134个，其中146个和39个链接与HostP进一步连接(图3，补充表9和10)。

对于这些联系，它们的中介效应明显大于其反向对应物(扩展数据图4c，补充表9和10)，表明微生物群通过调节炎症影响代谢物的替代假设不太可能。

为评估多组学模块关联在各自炎症环境中的相对重要性，我们使用每组关联的MetaG-MetaB-HostT模块进行随机森林回归，以预测痰中性粒细胞或嗜酸性粒细胞的百分比。

在发现和验证数据集之间对模型进行交叉验证，并按可预测性对模块集进行排序。

对于中性粒细胞炎症，最具预测性的模块集包括与MetaB-M056中的吲哚-3-乙酸(IAA)相关的色氨酸分解代谢(P00380)(补充数据图4d)。基于IAA与模块中细胞周期蛋白D1相互作用的证据，该MetaB模块又与富含白细胞介素-22(IL22)信号通路的HostT-M318相关联(图4a)。

这些模块与痰中性粒细胞百分比呈负相关，共同预测了其60.7%的变化率。

注意到已确定的MetaB-HostT联系仅代表现有的证据，我们还探讨了与每个MetaB模块相关的top HostT模块的功能属性，无论它们是否由先前的知识联系起来。

我们发现，IAA所属的MetaB-M056与富含上皮细胞凋亡、IL-1信号和氧化应激的HostT模块有显著的负相关关系(图4a)。痰液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-1β和IL-6，以及血清瘦素和粒细胞集落刺激因子与这些HostT模块关联最强，其中IL-1β和IL-6进一步与富含IL-1信号通路的HostT-M076关联(图4a)。

这些结果共同支撑了一个机制假设，即慢阻肺气道菌群中色氨酸代谢的改变可能导致IAA降低，进而导致对中性粒细胞炎症和上皮细胞凋亡的保护作用丧失。 

其他对嗜中性COPD具有高度预测性的微生物组-代谢物-宿主关联包括酪氨酸降解(M00044)和富马酸盐生成(在MetaB-M100中)、天冬氨酸代谢(P00250)和L-谷氨酸生成(在MetaB-M006中)，它们都与嗜中性粒细胞趋化性和可溶性晚期糖基化终末产物受体及IL-17A表达有关，但方向相反(图4a)。

对于嗜酸性粒细胞COPD，最具预测性的联系是甘油磷脂代谢(P00564)和胆碱产生(在MetaB-M123中)，这与嗜酸性粒细胞趋化性和IL-5和eotaxin-2表达有关(图4a)。这些模块共同解释了嗜酸性粒细胞百分比变化的83.5%。我们在预测中性粒细胞时观察到模型性能呈连续分布，而在预测嗜酸性粒细胞时则呈双峰分布(补充图5)。

这表明，与嗜酸性粒细胞COPD气道相比，嗜中性粒细胞COPD气道中的微生物生态系统可能更复杂，由许多可能具有类似相关性的微生物-宿主相互作用构成。补充表9和10中提供了微生物-代谢物-宿主相互作用的综合列表。 为了确定驱动多组学关联的微生物物种，我们通过测量模块水平关联的改变进行了LOSO分析，迭代排除了MGS。

我们发现，色氨酸代谢(P00380)和涉及IAA的MetaB-M056之间的相关性受Lactobacillus salivarius的驱动最大，其次是Streptococcus mitis和Neisseria subflava(补充数据图4e和补充表9)。我们还对该模块中的每个单独的KO进行了LOSO分析，发现Lactobacillus salivarius对K01426的改变贡献最大(补充数据图4e)。

该基因编码催化IAA生物合成步骤的amiE，这表明Lactobacillus salivarius和IAA生产之间可能存在因果关系。

同样的LOSO分析使用基因级别的分类法得出了总体上类似的结果，发现另外一个丰度较低的乳杆菌物种Lactobacillus oris是K01426变化的贡献者(补充图6)。

尽管具有显著性，但IAA、P00380和K01426丰度的效应大小在COPD和对照组之间相对较小(图4b)，组内高变异性可能反映了疾病的异质性。

除了两种乳杆菌属物种外，还有58种其他物种对宏基因组中的K01426有贡献，包括在COPD中升高并能够产生IAA的P. aeruginosa。

总体而言，与对照组相比，COPD中对K01426和其他色氨酸分解代谢基因有贡献的微生物群落多样性较低(补充图7)。

COPD中这些基因的相对丰度降低可能是P. aeruginosa增加和其他细菌物种减少的净结果(补充图7)。

与对照组相比，COPD中细菌总负荷的降低导致COPD中具有K01426的物种的绝对总量减少(图4b)。

图3 慢阻肺中微生物组-代谢物-宿主相互作用概述。

聚类热图分别显示嗜中性粒细胞或嗜酸性粒细胞炎症的序列中介分析(MetaG-Metab、Metab-HostT、HostT-HostP)中显著相关的MetaG、Metab、HostT模块和HostP特征。

具有显著中介效应的配对模块以其相关方向性(FDR<0.05)着色，没有显著中介效应的模块以白色显示。具有生物学联系的显著中介模块以暗红色表示。

彩色单元格的透明度与相关强度成正比。多组学模块与痰嗜中性粒细胞(NEU)或嗜酸性粒细胞(EOS)百分比的Spearman相关性，以及MetaG模块的功能类别在热图旁边标明。

AgRP，刺鼠相关蛋白；BMP，骨形态发生蛋白；FABP2，肠型脂肪酸结合蛋白2；IGF-1，胰岛素样生长因子1；IGFBP-1，胰岛素样生长因子结合蛋白1；LAP，潜态相关肽；LIGHT，肿瘤坏死因子配体超家族成员14；MIP-3α，巨噬细胞炎性蛋白3α；MMP-1，基质金属蛋白酶-1；MSP，巨噬细胞刺激蛋白；PECAM-1，血小板内皮细胞黏附分子-1；PGRP-S，肽聚糖识别蛋白；RANTES，正常T-细胞表达和分泌的受激活调节因子；SCF，干细胞因子；TREM，髓系细胞触发受体。

图4 慢阻肺中微生物组-代谢物-宿主相互作用关联。

a.分别对嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞COPD中前三和前一微生物-宿主相互作用进行生物学解释。

生物学联系用红色箭头表示。CCL2，C-C基序趋化因子配体2；G-CSF，粒细胞集落刺激因子；mTORC1，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1；NRF2，核因子红细胞2相关因子2；PKA，蛋白激酶A；ROS，活性氧；TGF-β1，转化生长因子β1。

b.箱形图显示IAA的原始强度(n=129，广州P=0.0029，深圳P=0.026)，P00380富集分数(n=135，广州P=0.0016，深圳P=0.0044)，K01426的每千个碱基每百万映射reads的片段(n=135，广州P=0. 049，深圳P=0.016)和拥有K01426的物种的总绝对丰度(n=106，广州P=0.32，深圳P=0.026)，在COPD和对照中通过将其相对丰度之和乘以qPCR获得的总细菌量来估计。显著性通过双侧Wilcoxon秩和检验确定。NS，不显著；**P<0.01；*P<0.05。 

IAA可改善肺功能衰退、炎症和细胞凋亡 

色氨酸代谢、IAA和宿主炎症及细胞凋亡途径之间的关联促使我们探索其潜在的因果关系。

为了确定气道中的IAA是否来自肺部或肠道微生物群，我们用广谱抗生素对小鼠进行鼻内处理，以专门清除肺部细菌。

这导致肺部总细菌负荷和Lactobacillus明显减少(补充数据图5a,b)。经鼻给药后，支气管肺泡灌洗液(BALF)中的IAA水平明显降低，而小鼠血清中的IAA水平没有明显改变(图5a和补充数据图5c)。

相比之下，无论是灌胃还是在饮用水中给药相同的抗生素都会导致盲肠中的总细菌量和Lactobacillus减少，但没有明显改变肺部的细菌负荷或BALF中的IAA含量(补充数据图5d-f)。

这些结果证实了气道微生物组是IAA产生的来源。

接下来，我们通过每周给药脂多糖(LPS)和弹性蛋白酶(ELT)(持续4周)来建立肺气肿小鼠模型。该模型模拟了中性粒细胞COPD的关键病理特征，包括肺功能受损、肺气肿、组织损伤和气道炎症(图5b、c和补充数据图6a、b)。与对照小鼠相比，肺气肿的BALF中IAA显著减少(补充数据图6c)。

在肺气肿小鼠中腹腔给药IAA可减轻肺功能衰退、肺气肿、组织损伤、胶原蛋白沉积和TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-17A的水平(图5b、c和补充数据图6a-e)。

给药IAA增加了小鼠肺中的IL-22和cyclin D1水平(图5d和补充数据图6f)，以支持人类多组学联系

。IAA的作用通过鼻内给药途径得到验证(补充图8)，支持IAA在局部发挥作用。本研究发现IAA减轻了肺组织的凋亡，改变了凋亡蛋白Bax、Bcl-2和cleaved caspase-3的表达(图5e-g)。

组织重建在IAA的作用下得到改善，Claudin-1和occludin表达上调(图5g)。IAA还减少了中性粒细胞浸润(补充数据图6g，h)。

IAA诱导的肺功能恢复和IL-22的产生在接受芳香烃受体(AhR)抑制剂治疗的小鼠中被消除(图5h和补充数据图7a)，表明IAA作用是AhR依赖性的。

IL-22的中和逆转了IAA对细胞凋亡的影响，但对炎症介质没有显著影响(IL-17A除外，图5i和补充数据图7b-e)。

我们发现与其他细胞来源(包括第3组先天淋巴细胞、CD4+T细胞和自然杀伤(NK)T细胞)相比，IAA导致肺泡和肺间质巨噬细胞产生更多IL-22(图5j，补充数据图7f)。

小鼠肺部转录组特征、细胞纯化和耗竭试验进一步证实了这一点(补充数据图8和补充图11-14)。在COPD患者的诱导痰中观察到IAA和CD68+CD206+IL-22+巨噬细胞之间的正相关关系(n=7，补充图15)。IAA诱导肺气肿小鼠中STAT5的磷酸化，而不是STAT1或STAT3，表明STAT5可能参与IAA-IL-22轴(补充图16)。

IAA的作用在香烟烟雾诱导的COPD小鼠模型中得到验证(补充图9和补充图17)。然后，我们探讨了两种Lactobacillus的作用，即L. salivarius和L. oris，作为气道IAA的潜在生产者。鼻内处理这两个物种或它们的组合6周，改变了小鼠肺部微生物组，增加了Lactobacillus的丰度(补充图18a)。

在单独接种Lactobacillus和L. salivarius以及P. aeruginosa后，小鼠BALF中的IAA明显增加(图5k)。

对照物种Aggregatibacter actinomycetemcomitans的鼻内处理没有改变BALF中的IAA水平，该物种在宏基因组中与L. salivarius呈反比关系，并且不具有IAA生物合成基因(补充图18b)。

同时接种两种Lactobacillus可以缓解肺功能衰退、组织损伤和细胞凋亡，并降低IL-1β、IL-6和IL-17A的水平(图5k和补充数据图10)。

图5 IAA可改善肺功能衰退、中性粒细胞炎症和细胞凋亡。

a.条形图显示鼻腔给药时IAA水平降低(n=5)。RT，保留时间。b.条形图显示IAA可改善肺气肿模型小鼠的肺功能下降，内毒素和EL-T每周鼻腔给药1次，共4周(n=5)。

c.肺组织病理学评分条形图显示IAA可减轻肺气肿小鼠模型(n=5)的组织损伤。d.条形图显示IAA增加了肺气肿小鼠模型(n=5)的气道IL-22水平。

e.条形图显示IAA降低了肺气肿小鼠模型(n=5)的细胞凋亡率。f.四组具有代表性的苏木精-伊红染色肺切片图像和TUNEL荧光图像。

黑色箭头表示炎性浸润物。白色箭头表示TUNEL阳性细胞。

g.Western blots显示IAA改变了肺气肿小鼠模型中Claudin-1、occludin、Bax、Bcl-2和cleaved caspase-3的表达(n = 3)。

免疫印迹旁边的圆图显示了相对蛋白水平的平均值和标准差。i.条形图显示，当IL-22被中和时，IAA对肺功能的影响被削弱(n=5)。

j.流式细胞仪显示，在肺气肿小鼠模型中，IAA使IL-22+肺泡巨噬细胞(F4/80+CD11c+CD11b-IL-22+)数量增加(n=5)。k.条形图和Western blots显示，在肺气肿小鼠模型中，鼻内接种L. salivarius(LS)、L. oris(LO)及其混合培养物(LS+LO)，IAA水平增加(n=5)，Bax、Bcl-2和cleaved caspase-3的表达发生改变(n=3)。鼻内接种P. aeruginosa的IAA水平也被显示出来(n=5)。

相对蛋白质水平的平均值和标准差显示在免疫印迹旁边的圆形图中。条形图显示为mean±s.d。使用双侧Student’s t检验确定显著性。源数据中提供了精确的P值。  

IAA通过巨噬细胞-上皮细胞互作抑制细胞凋亡 

巨噬细胞产生IL-22参与IAA的抗凋亡作用，促使我们探索巨噬细胞和上皮细胞在对IAA的反应中可能存在的相互作用。

在体外，香烟烟雾提取物(CSE)处理的小鼠巨噬细胞系RAW264.7减少了IL-22的产生，而IAA则挽救了CSE攻击的巨噬细胞中IL-22的水平(图6A)。

用AhR抑制剂预处理RAW264.7可减弱IAA的作用(图6A)。IAA还抑制CSE诱导的RAW264.7细胞中TNF-α的产生(补充图19A)。

这些结果在小鼠原代肺泡巨噬细胞中得到了验证(图6A和补充图19A)，并共同证实了巨噬细胞在IAA刺激下产生的IL-22增加。 

同时，IL-22对CSE刺激的小鼠肺上皮细胞系MLE12的处理减轻了细胞凋亡并促进了上皮重塑(图6B，C和补充图19B)。Bax/Bcl-2比值的改变和cleaved caspase-3表达也重现了小鼠实验的结果(图6d，e)。

然而，用IAA直接处理CSE刺激的MLE12细胞对细胞凋亡几乎没有影响(补充图19c)，表明IL-22介导的“巨噬细胞-上皮细胞”互作可能发挥作用。

我们使用细胞共培养试验进一步证明了这一点(补充图19d)。在RAW264.7–MLE12共培养系统中，向RAW264.7增加IAA显著降低了MLE12细胞的凋亡，该效应被系统中IL-22的中和所逆转(图6f)。

此外，当STAT5而不是STAT1或STAT3被抑制时，IL-22对CSE诱导的MLE12凋亡的保护作用被取消(图6g和补充图19e)。

综上，这些结果表明，IAA通过IL-22介导的巨噬-上皮互作改善细胞凋亡(补充图20)。

图6 IAA通过IL-22介导的巨噬-上皮互作抑制细胞凋亡。

a.条形图显示IAA可使小鼠巨噬细胞系RAW264.7(n=6)和CSE刺激的小鼠原代肺泡巨噬细胞(n=3)的IL-22水平升高。

b，c，流式细胞术(b，n=3)和TUNEL法(c，n=3)显示，IL-22可降低CSE诱导的小鼠肺泡上皮细胞系MLE12的凋亡率。TUNEL阳性细胞用白色箭头表示。

PI，碘化丙啶。d.免疫荧光染色显示CSE刺激的MLE12细胞(n=3)中IL-22改变了cleaved caspase-3(cl-caspase-3)的水平。

E、Western blotting显示IL-22诱导的MLE12细胞Bax/Bcl2比值改变(n=3)。

f，共培养试验显示IAA显著减少了MLE12中的细胞凋亡，当IL-22在系统中被中和时，这种细胞凋亡被消除(n=3)。

g，流式细胞仪显示，当STAT5，而不是STAT1或STAT3被特异性抑制时，IL-22在CSE刺激的MLE12细胞中的凋亡逆转率(n = 3)。

条形图显示为mean±s.d.。使用双侧Student’s t检验来确定显著性。精确的P值在源数据中提供。NS，不显著；

讨论

本研究通过对微生物和宿主多组学的综合分析，展示了COPD气道微生物-宿主相互作用的概况。

与嗜酸性粒细胞COPD相比，我们发现嗜中性粒细胞的气道微生物-宿主关联更为明显。氨基酸合成代谢相对于分解代谢的宏基因组潜力升高证明了这一点，这导致氨基酸在其代谢物上积累。

具体而言，气道微生物群中色氨酸分解代谢减少导致COPD中IAA生成减少，从而导致炎症增加、上皮细胞凋亡和肺功能下降。 与肠道和口腔相比，气道宏基因组的研究明显不足。

我们重建了近300万个微生物基因和384个中等及以上质量的MGS，极大地扩展了呼吸道微生物基因库。

我们开发了一个工作流程，通过沿“微生物组-代谢物-宿主”轴的中介效应分析来评估多组学关联，并利用微生物遗传信息和代谢物-靶标配对信息，确定“微生物-宿主”互作的机制假设。

结果表明，COPD气道中存在复杂的微生物生态系统，中性粒细胞炎症可能比嗜酸性粒细胞炎症更重要。

需要注意的是，COPD的多组学改变特别是由疾病严重程度增强的一部分患者驱动的。

相比之下，早期COPD患者气道微生物与宿主的相互作用较少受到干扰。

多组学揭示的一个关键机制联系是，气道微生物组产生的IAA可能缓解慢阻肺嗜中性粒细胞炎症和上皮细胞凋亡。

我们通过实验证明，气道IAA可能是局部衍生的，支持微生物-宿主的直接相互作用。

从机制上讲，IAA通过在肺巨噬细胞中产生AhR依赖性IL-22来减轻细胞凋亡，从而防止肺气肿和肺功能下降，这表明巨噬细胞是COPD发病过程中IL-22的相关来源。

然而，作为IL-22的主要来源(即CD4+T细胞)的其他淋巴样细胞也可能参与其中。

我们的结果还应与Starkey等人的结果相结合，表明IL-22在COPD中的多功能性。

我们发现两种乳酸菌是潜在的气道IAA生产者。它们常见于口腔，但在下呼吸道也检测到L. salivarius。它们的抗炎和抗凋亡特性支持口腔共生菌影响肺部病理。

值得注意的是，气道微生物群的其他成员，包括像P. aeruginosa这样的病原菌，也可能产生IAA，这增加了微生物-宿主相互作用的复杂性，并表明有必要解开单个细菌物种对净代谢的贡献。

转录水平上的差异也可能解释了在COPD患者气道中观察到的P. aeruginosa增加和IAA减少的原因，这值得进一步研究。

其他吲哚衍生物，如吲哚-3-乳酸，吲哚-3-丙酸和吲哚-3-乙醛也介导了微生物与宿主的互作，其在COPD中的作用仍有待研究。 

本研究存在一些局限性。首先，人类多组学分析是横断面的，与那些基于16S rRNA基因的调查相比，样本量是中等的。

这就需要进行适当的降维，以规避多重假设检验中的的挑战。

其次，尽管诱导痰液被广泛用作研究气道微生物组的替代物，但它代表了来自上呼吸道和下呼吸道的物质的固有混合物。

痰液中的微生物和代谢物的分区来源不能明确确定。

这一局限性通过小鼠验证得到部分克服，在小鼠中，肺组织和BALF被直接采样。

第三，建立小鼠鼻内注射内毒素和ELT 4周的动物模型。该模型能够复制中性粒细胞COPD的一些病理特征，但可能不能完全代表患者的复杂病理。

此外，内毒素的微生物来源可能会在模型中产生混杂的影响，因为呼吸道微生物群也可能产生内毒素。在香烟烟雾诱导的小鼠模型中验证了IAA的表型效应。

然而，IAA在这种情况下的作用机制还需要进一步评估。最后，尽管我们确定了与嗜酸性粒细胞COPD有关的微生物-宿主联系，但其因果关系需要在具有2型炎症的肺气肿动物模型中进行研究。 

本研究的结果表明，气道微生物群产生的代谢物可以介导COPD的关键病理生理特征，并为靶向微生物-宿主相互作用治疗提供了机制基础。

微生物与人类系统共同进化的兼容性为发现类药物分子(如IAA)提供了丰富的资源，这些分子是人类途径的特定调节剂。

在这里提出的多组学图谱基础上的进一步研究可能为改变微生物-宿主相互作用作为COPD的治疗策略开辟途径。