功能性GPCR抗原的设计和制备策略

G蛋白偶联受体 (GPCR) 是人类最大的膜蛋白超家族，通过 G 蛋白的结合和解离，在介导细胞内信号传导、诱导细胞增殖、细胞生长和细胞运动以及对外部刺激的反应等方面发挥着关键作用。许多临床研究表明，GPCRs功能异常与多种人类疾病高度相关，影响患者生存率。因此，GPCRs 是治疗各种疾病的关键药物靶点，其靶向药物占美国食品和药物管理局 (FDA) 批准的所有药物的 30% 以上。

与小分子化学药物和小肽相比，治疗性抗体具有靶点特异性更高、副作用更少、血清循环半衰期更长等诸多优势。然而，尽管单克隆抗体产品在治疗多种疾病方面取得了临床和营销成功，但只有两种抗 GPCR 治疗性抗体药物获得批准上市，即安进公司的 erenumab（商品名：Aimovig），靶向降钙素基因相关受体（CGRPR）来治疗偏头痛[1] 和 Kyowa Kirin 的 mogamulizumab（商品名：Poteligeo），靶向趋化因子受体 4 (CCR4) 治疗难治性蕈样肉芽肿和 Sézary 综合征 [2]。

对于成功得到具有治疗功能的GPCR 抗体，纯化具有天然构象的GPCR抗原至关重要。特别是含有七个跨膜α-螺旋的GPCRs通常在异源表达系统中以非常低的水平表达。因此，很难将具有天然构象的抗原纯化为可溶形式。此外，整个 GPCR 结构中 GPCR 胞外区域表面积非常有限，使得制备作为治疗性抗体靶标的GPCR 抗原尤其困难。尽管抗原制备是治疗性GPCR抗体开发中最困难的步骤之一，但两种GPCR 抗体已经克服了这些挑战，并且获得了批准。此外，数十种GPCR抗体在临床试验过程中。在这篇文章中，我们重点关注最近获得批准或正在进行临床试验的治疗性GPCR 抗体（表 1），以及这些抗体是通过怎样的抗原设计和处理方法制备得到的。

表 1

融合蛋白法

GPCR的细胞外区域与其配体之间的相互作用触发蛋白质细胞内区域的构象变化，从而导致 G 蛋白的结合和细胞外信号传递到细胞中。GPCR 由 7 个跨膜螺旋、4个胞外环组成：N 末端、胞外环 1 (ECL1)、胞外环 2 (ECL2) 和胞外环 3 (ECL3)，以及四个胞内环：胞内环 1 (ICL1 )、胞内环 2 (ICL2)、胞内环 3 (ICL3) 和 C 端。每个GPCR 独特的三维结构决定了其配体特异性以引发其特征性细胞反应。为了制备识别 GPCR 细胞外区域的抗体，一个简单的策略是将GPCR 细胞外区域部分与载体蛋白融合。制备的抗原可用于动物免疫或从人类天然抗体库中筛选抗体。尽管用载体蛋白制备的胞外区无法完全模拟天然 GPCR 的胞外区构象，但一些含有糖基化等翻译后修饰的人源 GPCR 胞外区可以在哺乳动物细胞中表达。利用GPCR 细胞外环与载体蛋白融合的方法成功制备得到的抗体包括靶向降钙素基因相关受体 (CGRPR)的抗体erenumab[3]，靶向趋化因子受体 4 (CCR4) 的抗体mogamulizumab [4]，和靶向 Frizzled- 7 (FZD7)的vantictumab [5]。

Erenumab 是一种针对降钙素基因相关肽受体 (CGRPR) 的拮抗性单克隆抗体，由降钙素受体样受体 (CLR) 和受体活性修饰蛋白 1 (RAMP1) 组成，用于治疗慢性偏头痛。CGRPR通过Gαs蛋白释放后的血管舒张和腺苷酸环化酶的激活与偏头痛密切相关 [33,34]。基于 CGRP 结合位点跨越 CLR 和 RAMP1 的细胞外区域的发现 [35]，由 RAMP 的胞外域和 CLR 的 N 端细胞外区域组成的异二聚体 Fc融合蛋白被设计为抗原分离 CGRPR 拮抗抗体 (图 1)。此外，将制备的异源二聚体 Fc 融合物免疫到 XenoMouse 中以产生 erenumab，然后进行杂交瘤筛选 [36,37]（图 4b）。Erenumab 显示出对 CGRPR 的高结合亲和力（KD = 56 pM）和对 cAMP 的强抑制（IC50 = 2.3 nM）[38]。在 III 期临床试验中，每月接受 70 mg 和 140 mg erenumab 治疗至少 6 个月的患者偏头痛天数分别减少了 43.3% 和 50% [40]，这些疗效结果使erenumab成为美国 FDA 和欧洲药品管理局 (EMA) 批准的第一个GPCR抗体药物。

图1

Mogamulizumab 是一种针对趋化因子受体 4 (CCR4) 的抗体，用于通过增强抗体依赖性细胞介导的细胞毒性 (ADCC) 使 GPCR 失活和清除靶细胞来治疗 T 细胞白血病。为了分离抗 CCR4 抗体，将N 端胞外区（28 个氨基酸：N2-C29）与匙孔血蓝蛋白（KLH）融合（图 4c），并注射到小鼠体内进行免疫和抗体筛选。

图2

以目的蛋白过表达细胞或细胞膜作为抗原

使用表达 GPCR 的细胞（图 3）作为抗原的方法受到很多限制。由于细胞膜存在许多其他成分，很难在细胞表面过表达目标 GPCR 。 此外，在抗体筛选过程中需要非常小心的处理脆弱的细胞。

图3

用表达目标 GPCR 细胞的细胞膜（图4）部分作为抗原是一种替代方法。这种方法的最大优势是它能够维持目标GPCR的天然构象，从而制备能够识别 GPCR 天然结构的抗体。

图4

使用以上两种方法成功筛选抗体的代表性例子是靶向胰高血糖素样肽-1 受体 (GLP1R) 的glutazumab [6,7]，靶向胰高血糖素受体 (GCGR) 的volagidemab [8]，靶向趋化因子受体 2 (CCR2) 的volagidemab [9]，靶向 C-C 趋化因子受体 5 (CCR5) 的leronlimab (Pro 140)，[10]，靶向 C-X-C 趋化因子受体 4 型 (CXCR4) 的ulocuplumab (BMS-936564) [11] 和靶向 C5a 受体 (C5aR) 的avdoralimab (IPH5401)[12]

蛋白质重组表达纯化法

图5

使用纯化得到的重组 GPCR 蛋白作为抗原可以排除细胞膜上的许多不相关成分的干扰。尽管有报道称利用哺乳动物细胞、昆虫细胞等真核细胞表达系统，通过优化表达条件和使用去垢剂等方法成功纯化了功能性 GPCR，但能否纯化成功因 GPCR 的类型而异。此外，由于从细胞膜中提取的GPCR结构可能与天然 GPCR 不同，因此无法保证纯化的 GPCR 和细胞膜上GPCR相比与配体结合亲和力相同。为了有效生产功能性天然样 GPCR，可以从以下方面来尝试，包括 (i) 提高GPCR 在细胞膜表面的表达水平，(ii) 提高 GPCR 的溶解度和稳定性，以及 (iii)通过重组步骤以保持 GPCR 的活性构象。重组的方法主要有病毒样颗粒（virus-like particle, VLP）和脂质体重组两种方式，见图6。

图6

其他方法

使用 GPCR 编码 DNA 作为抗原的最大优势是绕过复杂的 GPCR 表达纯化过程。当编码 GPCR 抗原的 DNA 被克隆到载体中并注射到动物宿主中时，它会产生异源 GPCR 蛋白抗原和 GPCR 过表达细胞。由此产生的 GPCR 抗原能够通过动物宿主的免疫反应分离特异性抗体。然而，注射的 DNA 很容易被动物的免疫反应分解。此外，在抗原性 GPCR 表达低的情况下，很难分离出靶标特异性抗 GPCR 抗体。

当抗原蛋白质结构复杂或蛋白质生产非常困难时，可以尝试截取短肽作为抗原，例如可以使用由 GPCR 细胞外环序列肽链来制备GPCR特异性抗体。然而，GPCR胞外环结构的肽链很难模拟天然GPCR，而且短肽抗原在免疫动物体内容易降解。

总结

由于其复杂的结构，GPCR是极具挑战性的抗原，很难分离得到治疗性抗体。然而如上文所述，各种制备功能性 GPCR 抗原的策略不断被开发出来。随着GPCR抗原制备方法的发展，各种尖端的抗体分离平台也应运而生。结合高效的 GPCR 抗原制备方法和先进的抗体筛选技术，相信很快会有多种具有新作用机制的GPCR 治疗性抗体问世。

参考文献1.Dolgin, E. First GPCR-directed antibody passes approval milestone. Nat. Rev. Drug Discov. 2018, 17, 457–459.2.Kasamon, Y.L.; Chen, H.; de Claro, R.A.; Nie, L.; Ye, J.; Blumenthal, G.M.; Farrell, A.T.; Pazdur, R. FDA Approval Summary: Mogamulizumab-kpkc for Mycosis Fungoides and Sezary Syndrome. Clin. Cancer Res. 2019, 25, 7275–7280.3.Markham, A. Erenumab: First Global Approval. Drugs 2018, 78, 1157–1161.4.Subramaniam, J.M.; Whiteside, G.; McKeage, K.; Croxtall, J.C. Mogamulizumab: First global approval. Drugs 2012, 72, 1293–1298.5.Smith, D.C.; Rosen, L.S.; Chugh, R.; Goldman, J.W.; Xu, L.; Kapoun, A.; Brachmann, R.K.; Dupont, J.; Stagg, R.J.; Tolcher, A.W.; et al. First-in-human evaluation of the human monoclonal antibody vantictumab (OMP-18R5; anti-Frizzled) targeting the WNT pathway in a phase I study for patients with advanced solid tumors. J. Clin. Oncol. 2013, 31, 2540.6.Li, C.; Yang, M.; Wang, X.; Zhang, H.; Yao, C.; Sun, S.; Liu, Q.; Pan, H.; Liu, S.; Huan, Y.; et al. Glutazumab, a novel long-lasting GLP-1/anti-GLP-1R antibody fusion protein, exerts anti-diabetic effffects through targeting dual receptor binding sites. Biochem. Pharmacol. 2018, 150, 46–53.7.Yan, H.; Gu, W.; Yang, J.; Bi, V.; Shen, Y.; Lee, E.; Winters, K.A.; Komorowski, R.; Zhang, C.; Patel, J.J.; et al. Fully human monoclonal antibodies antagonizing the glucagon receptor improve glucose homeostasis in mice and monkeys. J. Pharmacol. Exp. Ther. 2009, 329, 102–111.8.Pettus, J.; Reeds, D.; Cavaiola, T.S.; Boeder, S.; Levin, M.; Tobin, G.; Cava, E.; Thai, D.; Shi, J.; Yan, H.; et al. Effffect of a glucagon receptor antibody (REMD-477) in type 1 diabetes: A randomized controlled trial. Diabetes Obes. Metab. 2018, 20, 1302–1305.9.Gilbert, J.; Lekstrom-Himes, J.; Donaldson, D.; Lee, Y.; Hu, M.; Xu, J.; Wyant, T.; Davidson, M.; MLN1202 Study Group. Effffect of CC chemokine receptor 2 CCR2 blockade on serum C-reactive protein in individuals at atherosclerotic risk and with a single nucleotide polymorphism of the monocyte chemoattractant protein-1 promoter region. Am. J. Cardiol. 2011, 107, 906–911.10.Olson, W.C.; Rabut, G.E.; Nagashima, K.A.; Tran, D.N.; Anselma, D.J.; Monard, S.P.; Segal, J.P.; Thompson, D.A.; Kajumo, F.; Guo, Y.; et al. Difffferential inhibition of human immunodefificiency virus type 1 fusion, gp120 binding, and CC-chemokine activity by monoclonal antibodies to CCR5. J. Virol. 1999, 73, 4145–4155.11.Kuhne, M.R.; Mulvey, T.; Belanger, B.; Chen, S.; Pan, C.; Chong, C.; Cao, F.; Niekro, W.; Kempe, T.; Henning, K.A.; et al. BMS-936564/MDX-1338: A fully human anti-CXCR4 antibody induces apoptosis in vitro and shows antitumor activity in vivo in hematologic malignancies. Clin. Cancer Res. 2013, 19, 357–366.12.Massard, C.; Cassier, P.; Bendell, J.C.; Marie, D.B.; Blery, M.; Morehouse, C.; Ascierto, M.; Zerbib, R.; Mitry, E.; Tolcher, A.W. 1203P—Preliminary results of STELLAR-001, a dose escalation phase I study of the anti-C5aR, IPH5401, in combination with durvalumab in advanced solid tumours. Ann. Oncol. 2019, 30, v492.

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